ゼロバックグラウンドでの修復グリコシラーゼのラベルフリーかつリアルタイムセンシングのための自己指示型レプリケーションシステムの構築

Construction of a self-directed replication system for label-free and real-time sensing of repair glycosylases with zero background.

• Li-Juan Wang
• Ying-Ying Lu
• Chun-Yang Zhang

抄録

ゲノムDNAの損傷と修復は、代謝、疾患、老化など、複数の基本的な生物学的プロセスに関与している。本研究では、この自然修復機構にヒントを得て、修復グリコシラーゼをラベルフリーでリアルタイムに検出する自己複製システムの構築を初めて実証しました。本研究では、DNAグリコシラーゼの存在により、損傷した塩基の切除修復が触媒され、リサイクリング重合延長と鎖置換DNA合成により、指数関数的に増幅されたdsDNAの生成のための自己複製が連続的に自動開始される。このようにして得られたdsDNA生成物は、ラベルフリーで、蛍光指標としてSYBR Green Iを用いてリアルタイムでモニターすることができます。自己指示型指数関数的複製の高効率性と、複数のプライマー依存性増幅による非特異的増幅を効率的に抑制することにより、バックグラウンドが絶対的にゼロになることから、この方法は、検出限界が1×10 U μL、1細胞と高い感度を示し、さらに、阻害剤のスクリーニング、多様な癌細胞からのDNAグリコシラーゼの定量、さらには、DNAテンプレート中の特定の損傷塩基を変更するだけで、様々な修復酵素のモニタリングにも使用することができます。重要なことに、このアッセイは、単一のタイプのポリメラーゼのみを関与させることで、ラベルフリー、リアルタイム、等温で行うことができ、修復酵素関連の生物医学研究や臨床治療のためのシンプルで堅牢な普遍的なプラットフォームを提供しています。

Genomic DNA damage and repair are involved in multiple fundamental biological processes, including metabolism, disease, and aging. Inspired by the natural repair mechanism , we demonstrate for the first time the construction of a self-directed replication system for label-free and real-time sensing of repair glycosylases with zero background. The presence of DNA glycosylase can catalyze the excision repair of the damaged base, successively autostarting the self-directed replication through recycling polymerization extension and strand-displacement DNA synthesis for the generation of exponentially amplified dsDNAs. The resultant dsDNA products can be label-free and real-time monitored with SYBR Green I as the fluorescent indicator. Owing to the high efficiency of self-directed exponential replication and the absolute zero background resulting from the efficient inhibition of nonspecific amplification induced by multiple primer-dependent amplification, this strategy exhibits high sensitivity with a detection limit of 1 × 10 U μL and 1 cell , and it can be further used to screen inhibitors, quantify DNA glycosylase from diverse cancer cells, and even monitor various repair enzymes by simply changing the specific damaged base in the DNA template. Importantly, this assay can be performed in a label-free, real-time and isothermal manner with the involvement of only a single type of polymerase, providing a simple, robust and universal platform for repair enzyme-related biomedical research and clinical therapeutics.

This journal is © The Royal Society of Chemistry 2020.