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生細胞の転写とDNA修復機構の分子結合を一分子イメージングで明らかにした
Single-molecule imaging reveals molecular coupling between transcription and DNA repair machinery in live cells.
PMID: 32198374 PMCID: PMC7083905. DOI: 10.1038/s41467-020-15182-3.
抄録
大腸菌転写修復結合因子Mfdは、失速したRNAポリメラーゼを変位させ、失速部位をヌクレオチド切断修復因子UvrABに送達して損傷を検出する。このRNAポリメラーゼからUvrAへのハンドオフが、Mfd-UvrA-UvrB複合体を介して行われるのか、それとも細胞内の代替反応中間体を介して行われるのかは不明である。本研究では、活発に増殖している細胞でMfdを可視化し、ヌクレオチド切除修復タンパク質を忠実にリクルートするために必要な触媒機構を明らかにした。その結果、UvrAによるATP加水分解がMfd-UvrA複合体の形成と分解を支配していることがわかった。さらに、DNA負荷と損傷認識を欠損したUvrB変異体が形成するMfd-UvrA-UvrB複合体は、ハンドオフに成功していないことを明らかにした。また、Mfdとパートナー蛋白質との相互作用を一分子で解析した結果、Mfdの解離がUvrBのローディングに密接に結びついていることが明らかになり、UvrBのローディングが鎖特異的に起こるメカニズムが明らかになった。
The Escherichia coli transcription-repair coupling factor Mfd displaces stalled RNA polymerase and delivers the stall site to the nucleotide excision repair factors UvrAB for damage detection. Whether this handoff from RNA polymerase to UvrA occurs via the Mfd-UvrA-UvrB complex or alternate reaction intermediates in cells remains unclear. Here, we visualise Mfd in actively growing cells and determine the catalytic requirements for faithful recruitment of nucleotide excision repair proteins. We find that ATP hydrolysis by UvrA governs formation and disassembly of the Mfd-UvrA complex. Further, Mfd-UvrA-UvrB complexes formed by UvrB mutants deficient in DNA loading and damage recognition are impaired in successful handoff. Our single-molecule dissection of interactions of Mfd with its partner proteins inside live cells shows that the dissociation of Mfd is tightly coupled to successful loading of UvrB, providing a mechanism via which loading of UvrB occurs in a strand-specific manner.