改良DNAポリメラーゼによるホスホラミド酸結合DNAの合成

Synthesis of phosphoramidate-linked DNA by a modified DNA polymerase.

• Victor S Lelyveld
• Wen Zhang
• Jack W Szostak

抄録

既知のすべてのポリメラーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することにより、遺伝物質をコピーします。この高度に保存された活性は、結果として生じるプライマー鎖が末端水酸基を欠いている場合、組み込まれたヌクレオシドアナログが鎖伸長を終了させるという共通のメカニズムによって進行する。保存的に置換された3'-アミノヌクレオチドであっても、一般的には鎖終結剤として作用し、その重合のための酵素的経路はまだ発見されていません。3'-アミノヌクレオチドは化学的に結合してN3'→P5'ホスホロアミデート(NP)結合を持つ安定なオリゴヌクレオチドを得ることができるが、自然界ではそのようなインターヌクレオチド結合は存在しないことが知られている。ここでは、3'-アミノ末端のプライマーが、実際にはDNAポリメラーゼによってゆっくりと伸長されることを報告している。その補酵素がCaではなくMgである場合、反応は5倍速く、対応する3'-アミノ-2',3'-ジデオキシヌクレオシド5'-三リン酸塩からNP-DNA鎖を得るために、複数のターンオーバーNP結合形成を可能にしています。単一の活性部位の変異は、さらに追加の21倍のNP-DNA合成の速度を高めます。DNA依存性NP-DNAポリメラーゼ活性が保存された活性部位残基に依存していることを示し、結合した複合体の一連の結晶構造に基づいて、この活性の可能性の高いメカニズムを提案した。この結果は、ポリメラーゼ活性の触媒作用の範囲を大きく広げ、ネイティブ核酸とNP-DNAの間の遺伝的移行の可能性を示唆している。

All known polymerases copy genetic material by catalyzing phosphodiester bond formation. This highly conserved activity proceeds by a common mechanism, such that incorporated nucleoside analogs terminate chain elongation if the resulting primer strand lacks a terminal hydroxyl group. Even conservatively substituted 3'-amino nucleotides generally act as chain terminators, and no enzymatic pathway for their polymerization has yet been found. Although 3'-amino nucleotides can be chemically coupled to yield stable oligonucleotides containing N3'→P5' phosphoramidate (NP) bonds, no such internucleotide linkages are known to occur in nature. Here, we report that 3'-amino terminated primers are, in fact, slowly extended by the DNA polymerase from in a template-directed manner. When its cofactor is Ca rather than Mg, the reaction is fivefold faster, permitting multiple turnover NP bond formation to yield NP-DNA strands from the corresponding 3'-amino-2',3'-dideoxynucleoside 5'-triphosphates. A single active site mutation further enhances the rate of NP-DNA synthesis by an additional 21-fold. We show that DNA-dependent NP-DNA polymerase activity depends on conserved active site residues and propose a likely mechanism for this activity based on a series of crystal structures of bound complexes. Our results significantly broaden the catalytic scope of polymerase activity and suggest the feasibility of a genetic transition between native nucleic acids and NP-DNA.

Copyright © 2020 the Author(s). Published by PNAS.