戦艦」戦略を用いた高活性スクロースイソメラーゼのエンジニアリングによる製品特異性の向上

Engineering a Highly Active Sucrose Isomerase for Enhanced Product Specificity by Using a "Battleship" Strategy.

• Patrick Pilak
• André Schiefner
• Judith Seiboth
• Johannes Oehrlein
• Arne Skerra

抄録

Serratia plymuthica由来のショ糖異性化酵素SmuAは、食品産業で使用される人工甘味料であるイソマルチュロースへのショ糖の異性化を効率的に触媒する。しかし、副生成物であるトレハロースは吸湿性があるため、結晶性の製品を得るためには、さらに分離が必要である。そこで私たちは、まず、活性部位周辺にいくつかの探索的なアミノ酸交換を導入し、その影響を調べることで、SmuAの製品特異性を向上させました。次に、前のサイクルから有望な位置にあるが、異なる側鎖を持つ、あるいはその近傍の代替的な位置にある、2番目の突然変異のセットを考案した。わずか 55 点の突然変異を含む 7 回の反復サイクルの後、我々は 2.3 倍少ないトレハロース生成を示したが、依然として高い触媒効率（k /K = 11.8mM s ）を持っていたトリプル変異体 Y219L/D398G/V465E を得ました。この突然変異体 SmuA は、工業用生体触媒として魅力的に見えるだけでなく、戦艦ボードゲームに似た我々のセミレーショナルなタンパク質工学戦略は、他の困難な酵素最適化の取り組みにも興味を持ってもらえるはずである。

The sucrose isomerase SmuA from Serratia plymuthica efficiently catalyses the isomerisation of sucrose into isomaltulose, an artificial sweetener used in the food industry. However, the formation of a hygroscopic by-product, trehalulose, necessitates additional separation to obtain a crystalline product. Therefore, we have improved the product specificity of SmuA by first introducing a few exploratory amino acid exchanges around the active site and investigating their influence. Then, we devised a second set of mutations, either at promising positions from the preceding cycle, but with a different side chain, or at alternative positions in the vicinity. After seven iterative cycles involving just 55 point mutations, we obtained the triple mutant Y219L/D398G/V465E which showed 2.3 times less trehalulose production but still had high catalytic efficiency (k /K =11.8 mM  s ). Not only does this mutant SmuA appear attractive as an industrial biocatalyst, but our semirational protein-engineering strategy, which resembles the battleship board game, should be of interest for other challenging enzyme optimization endeavours.

© 2020 The Authors. Published by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.