ミツバチのサックブルードウイルスを形質転換と強化緑色蛍光タンパク質とのカップリングで可視化

Visualizing Sacbrood Virus of Honey Bees via Transformation and Coupling with Enhanced Green Fluorescent Protein.

• Lang Jin
• Shahid Mehmood
• Giikailang Zhang
• Yuwei Song
• Songkun Su
• Shaokang Huang
• Heliang Huang
• Yakun Zhang
• Haiyang Geng
• Wei-Fone Huang

抄録

ミツバチのサックブルードウイルス（SBV）は、属のピコルナウイルスです。その比較的小さくて単純なゲノム構造を考えると、1つだけORFを持つ単一の正鎖RNAは、完全なゲノム配列をクローニングすることは困難ではありません。しかし、ウイルスのタンパク質プロセスに関する情報が不足しているため、蜂イフラウイルスクローンに同義ではない変異を加えることは困難である。さらに、クローンへのレポーター遺伝子の追加は、これまでに一度も達成されたことがない。予備試験では、3'非翻訳領域（UTR）とポリ（A）の間の部位が付加された配列を保持できることを発見した。この部位にEGFP（enhanced green fluorescent protein）の発現を付加し、ウイルス遺伝子に影響を与えない発現タグを持つSBVクローンを作製した。黒女王細胞ウイルス（ＢＱＣＶ）由来の遺伝子間領域内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を挿入し、ＥＧＦＰ発現を開始させた。SBV-IRES-EGFPクローンは、感染に成功し、幼虫では単離され、経口接種を用いてパサージュされた。その結果，接種した幼虫は死亡率が高く，死んだ幼虫は嚢胞症状を示した．添加したIRES-EGFPは、複数回の継代を経てもクローン内に残り、感染したすべてのハチで期待されるEGFPを発現した。我々は、SBV の 3'-UTR と poly(A) の間の部位に遺伝子配列を付加する能力を実証し、他のハチイフラウイルスでもその可能性があることを示したが、そのメカニズムについてはさらなる調査が必要である。目的とするタンパク質発現レポーターを持つクローンは、ハチウイルス研究の貴重なツールとなるだろう。

Sacbrood virus (SBV) of honey bees is a picornavirus in the genus . Given its relatively small and simple genome structure, single positive-strand RNA with only one ORF, cloning the full genomic sequence is not difficult. However, adding nonsynonymous mutations to the bee iflavirus clone is difficult because of the lack of information about the viral protein processes. Furthermore, the addition of a reporter gene to the clones has never been accomplished. In preliminary trials, we found that the site between 3' untranslated region (UTR) and poly(A) can retain added sequences. We added enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression at this site, creating a SBV clone with an expression tag that does not affect virus genes. An intergenic region internal ribosome entry site (IRES) from Black queen cell virus (BQCV) was inserted to initiate EGFP expression. The SBV-IRES-EGFP clone successfully infected and , and in larvae, it was isolated and passaged using oral inoculation. The inoculated larvae had higher mortality and the dead larvae showed sacbrood symptoms. The added IRES-EGFP remained in the clone through multiple passages and expressed the expected EGFP in all infected bees. We demonstrated the ability to add gene sequences in the site between 3'-UTR and poly(A) in SBV and the potential to do so in other bee iflaviruses; however, further investigations of the mechanisms are needed. A clone with a desired protein expression reporter will be a valuable tool in bee virus studies.