アメントフラボンは、ヒト神経膠腫におけるオートファジー依存性フェロプトーシスを誘発することにより、細胞増殖を抑制し、細胞死を誘導します

Amentoflavone suppresses cell proliferation and induces cell death through triggering autophagy-dependent ferroptosis in human glioma.

• Yan Chen
• Ning Li
• Haijing Wang
• Ningning Wang
• Hui Peng
• Jing Wang
• Yihong Li
• Mingdi Liu
• Hui Li
• Yu Zhang
• Zhaohui Wang

抄録

エーアイエムズ:

神経膠腫は神経系の悪性腫瘍の中で最も一般的な腫瘍であり、その侵攻性と再発は治療の大きな障害となっている。本研究では、アメントフラボン（AF）の神経膠腫に対する効果を調べ、AFの抗がん作用の基礎的なメカニズムを明らかにすることを目的としています。

AIMS: Glioma is the most common type of malignant tumor of the nervous system, and aggressiveness and recurrence are major obstacles for treatment. This study is designed to explore the effects of amentoflavone (AF) on glioma, and to investigate the underlying mechanism of the anti-cancer activities of AF.

方法:

細胞形態は顕微鏡下で記録した。細胞生存率および細胞死率は、それぞれCCK-8アッセイおよび乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイにより決定した。細胞周期の進行はフローサイトメトリーで評価した。鉄、MDA（マロンジアルデヒド）、脂質活性酸素、GSH（還元型グルタチオン）はELISAキットを用いて評価した。サイクル関連タンパク質、フェロプトーシス関連タンパク質、オートファジー関連タンパク質、AMPK、mTOR、p70S6Kのリン酸化をウエスタンブロット法で解析した。オートファジーフラックスは、mRFP-GFP-LC3プラスミドを細胞にトランスフェクションすることにより観察した。生体内でのアメントフラボンの効果を解析するために、異種移植マウスモデルを樹立した。免疫組織化学アッセイを行い、LC3B、Beclin1、ATG5、ATG7、およびフェリチン重鎖（FTH）の発現を解析した。

METHODS: Cell morphology was recorded under microscopy. Cell viability and cell death ratio were determined by CCK-8 assay and lactate dehydrogenase (LDH) release assay, respectively. Cell cycle progression was assessed by flow cytometry. The levels of iron, MDA (malondialdehyde), lipid ROS, and GSH (reduced glutathione) were assessed by ELISA kit. The cycle-related proteins, ferroptosis-related protein, autophagy-related protein, and the phosphorylation of AMPK, mTOR and p70S6K were analyzed by western blotting. The autophagic flux was observed by transfecting cells with mRFP-GFP-LC3 plasmids. The xenograft murine models were established to analyze the effects of amentoflavone in vivo. The immunohistochemistry assay was performed to analyze the expression of LC3B, Beclin1, ATG5, ATG7, and ferritin heavy chain (FTH).

結果:

その結果、AFは細胞の生存率と細胞死を減少させることが明らかになった。さらに、AFは用量依存的に細胞周期の進行を抑制することが明らかになった。また、細胞内の鉄、MDA及び脂質OSは増加し、GSH及びミトコンドリア膜電位は減少した。また、AFはオートファジー関連タンパク質を制御することでオートファジーを促進することを明らかにした。また、AFによるオートファジー誘導はAMPK/mTORシグナルの制御と関連していることが示された。また、AFによるオートファジーの抑制効果は、DFO, フェレオスタチン-1, FTHのアップレギュレーションによっても逆転した。一方、FTHは化合物CとATG7のノックダウンにより増加した。さらに、オートファジー阻害剤Baf A1とATG7をノックダウンすることで、AF誘導性フェロプトーシスと細胞死を抑制することができた。また、オートファジー阻害剤Baf A1とATG7のノックダウンにより、オートファジーによるフェロプトーシスと細胞死を抑制することができた。また、AFにより腫瘍組織中のMDAレベルは増加し、腫瘍組織中のGSHレベルは用量依存的に減少した。さらに、LC3B, Beclin1, ATG5, ATG7の発現が増加し、FTHの発現が用量依存的に減少した。以上の結果から、AF はオートファジー依存的にフェロプトーシスを誘発することが明らかになった。以上の結果から、AF は神経膠腫の新規治療薬としての可能性が示唆された。

RESULTS: Our results showed that AF treatment led to reduction in cell viability and cell death. In addition, AF was found to block cell cycle progression in a dose-dependent manner in vitro. Following treatment with AF, the intracellular levels of iron, MDA, and lipid OS were increased, and the levels of GSH and the mitochondrial membrane potential were reduced. In addition, our results showed that AF promoted the autophagic by regulating autophagy-relevant proteins. Our results also showed that the autophagy-induction by AF was associated with regulation of AMPK/mTOR signaling. Mechanistically, the inhibition effects of AF on glioma cell were reversed by DFO, ferreostatin-1 as well as upregulation of FTH. Meanwhile, the FTH levels were increased by compound C and knockdown of ATG7. Moreover, both autophagy inhibitor Baf A1 and knockdown of ATG7 were able to compromising AF-induce ferroptosis and cell death. In vivo, the tumor growth was suppressed by AF in a dose-dependent manner. The level of MDA in the tumor tissue was increased while the level of GSH in tumor tissue was decreased by AF in a dose-dependent manner. Furthermore, the expression of LC3B, Beclin1, ATG5, ATG7 were increased, and the expression of FTH were decreased by AF in a dose-dependent manner in vivo. Conclusion These results demonstrate that AF triggered ferroptosis in autophagy-dependent manner. Our results suggest that AF has the potential to be considered as a novel treatment agent in glioma.

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