有機カチオン輸送体OCTN1 (SLC22A4)に対するコレステロールの効果

Effect of Cholesterol on the Organic Cation Transporter OCTN1 (SLC22A4).

• Lorena Pochini
• Gilda Pappacoda
• Michele Galluccio
• Francesco Pastore
• Mariafrancesca Scalise
• Cesare Indiveri

抄録

HeLa細胞から抽出したネイティブトランスポーターまたはヒト組換え型OCTN1を用いて再構成したプロテオリポソームにおいて、[C]-テトラエチルアンモニウムまたは[H]-アセチルコリンの取り込みとして測定したOCTN1の輸送活性に対するコレステロールの影響を調べた。再構成前にMβCDでネイティブトランスポーターからコレステロールを除去すると、輸送活性が低下した。このことは、再構成に使用した脂質混合物にコレステロールが含まれていることを示唆している。酵素アッセイの結果、プロテオリポソーム調製に使用したリン脂質混合物中に、1%のコレステロールに相当する10μgのコレステロール/mgの総脂質が存在することが明らかになりました。逆に、組換えOCTN1の活性は、プロテリポソーム調製物にコレステロールアナログ、CHSを添加することによって刺激されました。最適な輸送活性は、[C]-テトラエチルアンモニウムまたは[H]-アセチルコリン取り込みの両方のための 83 µg の CHS/mg の総脂質の存在下で検出されました。輸送の速度論的解析により、CHSによる輸送活性の刺激は、Kmの変化を伴わない輸送のVmaxの増加からなることが実証された。これらのデータは、コレステロールとタンパク質との直接的な相互作用を示唆している。この解釈をさらに支持するものとして、CARC-CRACモチーフに対応するいくつかのタンパク質部位とコレステロールの相互作用を示すドッキング解析がありました。コレステロールとOCTN1との直接的な相互作用が観察されたことは、コレステロールがOCTN1を介して腫瘍細胞や神経細胞および非神経細胞におけるアセチルコリン輸送に直接的な影響を与える可能性を示唆している。

The effect of cholesterol was investigated on the OCTN1 transport activity measured as [C]-tetraethylamonium or [H]-acetylcholine uptake in proteoliposomes reconstituted with native transporter extracted from HeLa cells or the human recombinant OCTN1 over-expressed in . Removal of cholesterol from the native transporter by MβCD before reconstitution led to impairment of transport activity. A similar activity impairment was observed after treatment of proteoliposomes harboring the recombinant (cholesterol-free) protein by MβCD, suggesting that the lipid mixture used for reconstitution contained some cholesterol. An enzymatic assay revealed the presence of 10 µg cholesterol/mg total lipids corresponding to 1% cholesterol in the phospholipid mixture used for the proteoliposome preparation. On the other way around, the activity of the recombinant OCTN1 was stimulated by adding the cholesterol analogue, CHS to the proteoliposome preparation. Optimal transport activity was detected in the presence of 83 µg CHS/ mg total lipids for both [C]-tetraethylamonium or [H]-acetylcholine uptake. Kinetic analysis of transport demonstrated that the stimulation of transport activity by CHS consisted in an increase of the Vmax of transport with no changes of the Km. Altogether, the data suggests a direct interaction of cholesterol with the protein. A further support to this interpretation was given by a docking analysis indicating the interaction of cholesterol with some protein sites corresponding to CARC-CRAC motifs. The observed direct interaction of cholesterol with OCTN1 points to a possible direct influence of cholesterol on tumor cells or on acetylcholine transport in neuronal and non-neuronal cells via OCTN1.