ハイスループットな遺伝毒性試験をサポートする外因性代謝活性化への3Rsフレンドリーなアプローチ

3Rs-friendly approach to exogenous metabolic activation that supports high-throughput genetic toxicology testing.

• Shuchang Tian
• Aiyana Cyr
• Karen Zeise
• Steven M Bryce
• Nikki Hall
• Jeffrey C Bemis
• Stephen D Dertinger

抄録

MultiFlow® DNA Damage-p53, γH2AX, Phospho-Histone H3 は、小型化されたフローサイトメトリーベースのアッセイであり、クラス トゲン、アニュージェン、および非遺伝毒性物質を区別することにより、遺伝毒性の作用機序情報を提供します。これまでの研究では、p53に対応したヒト細胞株TK6に焦点を当ててきた。哺乳類細胞を用いた遺伝毒性試験では、通常、ラット肝S9を濃縮した形で外因性代謝活性化剤を供給するが、これは3Rの考慮を含め、いくつかの理由からあまり好ましくないアプローチである。ここでは、低濃度のS9と、細胞および試験化学物質との接触を24時間連続して維持することを許可された飽和補因子を使用して、我々の経験を説明します。我々は、96ウェルプレート内のTK6細胞を、0.25％v/vフェノバルビタール/β-ナフトフラボン誘発ラット肝臓S9の存在下および非存在下の両方で、濃度の範囲にわたって15の参照化学物質のそれぞれに曝露した。処理の4および24時間後に、細胞アリコートを、作業用洗剤/ステイン/抗体カクテルを含むマイクロタイタープレートのウェルに添加した。短いインキュベーションの後、ロボットサンプリングは、ウォークアウェイフローサイトメトリーデータの収集のために採用された。PROASTベンチマーク用量（BMD）モデリングは、結果として得られた用量反応曲線を特徴付けるために使用されます。調査した8種類の基準プロジェノトキシコシントのそれぞれについて、相対核数、γH2AX、および/またはp53バイオマーカーのBMD値は、0%S9条件と比較して0.25%S9条件の方が桁違いに低かった。逆に、直接作用する参照化学物質のいくつかは、S9の存在下では細胞毒性および／または遺伝子毒性のBMD値が著しく低かった（例：レゾルシノール）。これらの結果は、低濃度S9システムの有効性を証明するものであり、効率的で拡張性の高い多重化試験法が、遺伝毒性効果を発揮するために生物活性化を必要とする化学物質を効果的に同定できることを示している。

MultiFlow® DNA Damage-p53, γH2AX, Phospho-Histone H3 is a miniaturized, flow cytometry-based assay that provides genotoxic mode of action information by distinguishing clastogens, aneugens, and nongenotoxicants. Work to date has focused on the p53-competent human cell line TK6. While mammalian cell genotoxicity assays typically supply exogenous metabolic activation in the form of concentrated rat liver S9, this is a less-than-ideal approach for several reasons, including 3Rs considerations. Here, we describe our experiences with low concentration S9 and saturating co-factors which were allowed to remain in contact with cells and test chemicals for 24 continuous hours. We exposed TK6 cells in 96-well plates to each of 15 reference chemicals over a range of concentrations, both in the presence and absence of 0.25% v/v phenobarbital/β-naphthoflavone-induced rat liver S9. After 4 and 24 hr of treatment cell aliquots were added to wells of a microtiter plate containing the working detergent/stain/antibody cocktail. After a brief incubation robotic sampling was employed for walk-away flow cytometric data acquisition. PROAST benchmark dose (BMD) modeling was used to characterize the resulting dose-response curves. For each of the 8 reference pro-genotoxicants studied, relative nuclei count, γH2AX, and/or p53 biomarker BMD values were order(s) of magnitude lower for 0.25% S9 conditions compared to 0% S9. Conversely, several of the direct-acting reference chemicals exhibited appreciably lower cytotoxicity and/or genotoxicity BMD values in the presence of S9 (eg, resorcinol). These results prove the efficacy of the low concentration S9 system, and indicate that an efficient and highly scalable multiplexed assay can effectively identify chemicals that require bioactivation to exert their genotoxic effects.

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