また、KirBac1.1の開活状態へのゲーティングに伴う構造変化を固体NMRと機能的アッセイにより明らかにした

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Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A..2020 02;117(6):2938-2947. 1915010117. doi: 10.1073/pnas.1915010117.Epub 2020-01-24.

また、KirBac1.1の開活状態へのゲーティングに伴う構造変化を固体NMRと機能的アッセイにより明らかにした

Conformational changes upon gating of KirBac1.1 into an open-activated state revealed by solid-state NMR and functional assays.

Reza Amani
Collin G Borcik
Nazmul H Khan
Derek B Versteeg
Maryam Yekefallah
Hoa Q Do
Heather R Coats
Benjamin J Wylie

PMID: 31980523 PMCID: PMC7022178. DOI: 10.1073/pnas.1915010117.

抄録

内向き整流器K(Kir)チャンネルの活性化とK伝導に必要な構造変化については、未だに議論されています。これらの構造変化は脂質結合によってもたらされる。このプロセスが高速ゲーティングとどのように関係しているのか、あるいはタンパク質の細胞内領域と細胞外領域が結合しているのかは不明である。ここでは、POPCと3:2 POPC:POPG（wt/wt）の活性化脂質混合物の両方に再構成されたKirBac1.1の構造の詳細を検討します。KirBac1.1は、ヒトのKirチャネルと相同性を共有する原核生物のKirチャネルである。我々は、リアルタイム蛍光消光アッセイとフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）距離測定を用いて、KirBac1.1がPOPC:POPG二重膜において構成的に活性な状態にあることを確認した。多次元固体NMR（SSNMR）分光実験により、この活性化脂質環境下でのタンパク質の膜貫通領域内の2つの異なるコンフォメーションを明らかにした。これら3つの異なるチャネル状態の間の違いは、オープンな活性化ゲートに関連したコンフォメーション変化を強調し、選択性フィルターと活性化ゲートを、両方の膜貫通らせん、タレット、選択性フィルターループ、細孔らせん間の相互作用を介して結びつけるユニークなアロステリック経路を示唆している。また、この構造変化に関与する特定の残基は、ヒトのKirチャネル間で高度に保存されていることを明らかにした。

The conformational changes required for activation and K conduction in inward-rectifier K (Kir) channels are still debated. These structural changes are brought about by lipid binding. It is unclear how this process relates to fast gating or if the intracellular and extracellular regions of the protein are coupled. Here, we examine the structural details of KirBac1.1 reconstituted into both POPC and an activating lipid mixture of 3:2 POPC:POPG (wt/wt). KirBac1.1 is a prokaryotic Kir channel that shares homology with human Kir channels. We establish that KirBac1.1 is in a constitutively active state in POPC:POPG bilayers through the use of real-time fluorescence quenching assays and Förster resonance energy transfer (FRET) distance measurements. Multidimensional solid-state NMR (SSNMR) spectroscopy experiments reveal two different conformers within the transmembrane regions of the protein in this activating lipid environment, which are distinct from the conformation of the channel in POPC bilayers. The differences between these three distinct channel states highlight conformational changes associated with an open activation gate and suggest a unique allosteric pathway that ties the selectivity filter to the activation gate through interactions between both transmembrane helices, the turret, selectivity filter loop, and the pore helix. We also identify specific residues involved in this conformational exchange that are highly conserved among human Kir channels.