AONによるスプライススイッチングとDMPKによるpre-mRNA分解を利用した筋緊張性ジストロフィー1型の治療アプローチの可能性

AON-induced splice-switching and DMPK pre-mRNA degradation as potential therapeutic approaches for Myotonic Dystrophy type 1.

• Ewa Stepniak-Konieczna
• Patryk Konieczny
• Piotr Cywoniuk
• Julia Dluzewska
• Krzysztof Sobczak

抄録

DMPK遺伝子の3'UTRにおける不安定なCTGリピートの拡大は、筋緊張性ジストロフィー1型（DM1）を引き起こす。CUGが拡張したDMPK転写物（CUGexp）は、Muscleblind-like（MBNL）代替スプライシング調節因子をリボ核内包物（病巣）に封じ込め、RNAの処理やスプライシングに異常をきたす。CUGexpの負担を軽減するために、我々はアンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）を介したDMPKのスプライススイッチングと変異したpre-mRNAの分解を利用した治療法を検討した。実験デザインは以下の通り。(i) RNA サーベイランス機構によるフレームシフトと毒性mRNAの分解を誘導するための選択された構成的エクソンのスキップ、および(ii) DMPK mRNAからCUGexpを運ぶ代替エクソン15(e15)を排除すること。最初の方法ではDMPKのmRNA崩壊を刺激することができなかったが、e15を排除することでDMPKの核輸出は促進されたが、CUGexpを含む潜在的に有害なスプライスアウトされたpre-mRNAフラグメントが蓄積される引き金となった。このフラグメントを、e15に先行するイントロニック配列に相補的なアンチセンスガプマーで中和しても、AONsの化学的毒性によるDM1特異的スプライスパシーを減少させることはできなかった。しかし、イントロニック配列のガプマーだけでは、DMPK mRNAのレベルを低下させ、スプライスオパシーや核病巣を含むDM1関連の細胞表現型を緩和した。したがって、DM1に対する安全なAONベースの治療戦略を設計するためには、正しい化学と実験的アプローチの組み合わせを慎重に検討する必要がある。

Expansion of an unstable CTG repeat in the 3'UTR of the DMPK gene causes Myotonic Dystrophy type 1 (DM1). CUG-expanded DMPK transcripts (CUGexp) sequester Muscleblind-like (MBNL) alternative splicing regulators in ribonuclear inclusions (foci), leading to abnormalities in RNA processing and splicing. To alleviate the burden of CUGexp, we tested therapeutic approach utilizing antisense oligonucleotides (AONs)-mediated DMPK splice-switching and degradation of mutated pre-mRNA. Experimental design involved: (i) skipping of selected constitutive exons to induce frameshifting and decay of toxic mRNAs by an RNA surveillance mechanism, and (ii) exclusion of the alternative exon 15 (e15) carrying CUGexp from DMPK mRNA. While first strategy failed to stimulate DMPK mRNA decay, exclusion of e15 enhanced DMPK nuclear export but triggered accumulation of potentially harmful spliced out pre-mRNA fragment containing CUGexp. Neutralization of this fragment with antisense gapmers complementary to intronic sequences preceding e15 failed to diminish DM1-specific spliceopathy due to AONs' chemistry-related toxicity. However, intronic gapmers alone reduced the level of DMPK mRNA and mitigated DM1-related cellular phenotypes including spliceopathy and nuclear foci. Thus, a combination of the correct chemistry and experimental approach should be carefully considered to design a safe AON-based therapeutic strategy for DM1.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.