融合タンパク質戦略を用いた脂質二重層ナノディスクへの膜タンパク質の挿入の定量化

Quantifying the insertion of membrane proteins into lipid bilayer nanodiscs using a fusion protein strategy.

• Elisabeth Häusler
• Kai Fredriksson
• Inguna Goba
• Carsten Peters
• Kolio Raltchev
• Laura Sperl
• Andrea Steiner
• Sevil Weinkauf
• Franz Hagn

抄録

膜タンパク質のオリゴマー状態は、様々な細胞プロセスにおいてその機能性を調節する。膜タンパク質は適切な膜ミメティックに可溶化されていなければならないため、従来の生物物理学的手法を用いてタンパク質のオリゴマーを分析することは困難でした。ここでは、脂質ナノディスクに挿入された膜タンパク質の数を決定する方法を紹介する。これは、脂質ナノディスクに組み込まれた後、膜タンパク質からタンパク質分解的に切断することができる小さくて堅牢な融合タンパク質の量を選択的に定量する能力に基づいています。定義されたアセンブリ条件でのナノディスクあたりの膜タンパク質の数の詳細な知識は、オリゴマー化の傾向を推定するために不可欠であるだけでなく、均質なオリゴマー状態の存在を必要とする構造研究のためのサンプルの最適化を導くためにも不可欠である。この方法は、ネガティブステインEMによって確認されたように、様々なアセンブリ条件でのナノディスク内のVDAC1チャネルの数を決定するために効率的に使用できることを示しています。この方法は、特に、シングルスパン膜貫通らせんなどの他の方法では容易にプローブすることができない膜タンパク質に適しています。このアッセイは、特別な装置を必要とせずにナノディスクに組み込むことができる任意の膜タンパク質に適用することができ、したがって、広く適用可能であり、脂質ナノディスク内の膜タンパク質の挿入を定量する他の方法を補完するものとなります。

A membrane protein's oligomeric state modulates its functionality in various cellular processes. Since membrane proteins have to be solubilized in an appropriate membrane mimetic, the use of classical biophysical methods to analyze protein oligomers is challenging. We here present a method to determine the number of membrane proteins inserted into lipid nanodiscs. It is based on the ability to selectively quantify the amount of a small and robust fusion protein that can be proteolytically cleaved off from a membrane protein after incorporation into lipid nanodiscs. A detailed knowledge of the number of membrane proteins per nanodisc at defined assembly conditions is essential to estimate the tendency for oligomerization, but also for guiding sample optimization for structural investigations that require the presence of a homogenous oligomeric state. We show that this method can efficiently be used to determine the number of VDAC1 channels in nanodiscs at various assembly conditions, as confirmed by negative stain EM. The presented method is suitable in particular for membrane proteins that cannot be probed easily by other methods such as single span transmembrane helices. This assay can be applied to any membrane protein that can be incorporated into a nanodisc without the requirement for special instrumentation and will thus be widely applicable and complementary to other methods that quantify membrane protein insertion in lipid nanodiscs.

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