CWPおよびPDR遺伝子の不活性化による原生植物酵母を用いた高感度ダイオキシン検出のためのレポーター遺伝子アッセイの改良

Improvement of reporter gene assay for highly sensitive dioxin detection using protoplastic yeast with inactivation of CWP and PDR genes.

• Masanobu Kawanishi
• Kentaro Mori
• Rina Yamada
• Sayoko Ito-Harashima
• Takashi Yagi

抄録

ダイオキシン類の検出性能を向上させた酵母レポーター遺伝子アッセイ系を確立した。酵母レポーター遺伝子アッセイ法は、比較的簡便で取り扱いが容易で安価であることから、環境汚染物質の各種評価に利用されてきた。我々は、これまでに lacZ レポーター遺伝子を有するアリル炭化水素受容体（AhR）および AhR 核内トランスロケータ（Arnt）を発現する酵母アッセイ株を構築し、ダイオキシン類の検出を行ってきた。本研究では、物質の流入を増加させ、流出を防ぐために、酵母アッセイ株の細胞壁マンノプロテインとATP結合カセットトランスポーターをコードする遺伝子を削除し、ダイオキシン類の検出法を確立した。また、これらの酵母のプロトプラストのアッセイ法を確立した。これらの改良により、検出限界は40倍に向上し、測定時間は40％短縮された。この酵母プロトプラストと廃棄用多層固相抽出カラムを用いた迅速な試料調製技術を組み合わせることで、ダイオキシン類を含む森林土壌1g中のダイオキシン類および関連化合物のリガンド活性を、土壌中のダイオキシン類に対する日本の環境基準の10倍の濃度で検出することができた。

A yeast reporter gene assay system with improved performance for dioxin detection was established. Since yeast reporter gene assays are relatively simple, easy to handle, and inexpensive, they have been used for various assessments of environmental contaminants. We previously constructed a yeast assay strain expressing the aryl hydrocarbon receptor (AhR) and AhR nuclear translocator (Arnt) carrying the lacZ reporter gene, for detection of dioxins. In the present study, genes encoding cell wall mannoproteins and ATP-binding cassette transporters in the yeast assay strains were deleted in order to increase the substance influx and prevent its efflux. We also established an assay procedure for protoplasts of these yeasts. These modifications improved the detection limit 40-fold and reduced the duration of the assay by 40%. By combining the yeast protoplast and a rapid sample preparation technique using disposal multilayer solid-phase extraction columns to remove unintended aryl hydrocarbons, this yeast reporter gene assay system detected the ligand activities of dioxins and related compounds in 1 g of forest soil containing dioxins at a concentration 10 times lower than the Japanese environmental standard for dioxins in soil.