δサブユニットでタグ付けされた組換えGABAA受容体のオリゴマー化と細胞表面発現

Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit.

• Furkan Enes Oflaz
• Çağdaş Devrim Son
• Ayla Arslan

抄録

γ-アミノ酪酸A型受容体（GABAAR）は、哺乳類の脳における一次阻害を担うヘテロペンタメリックな塩化物チャネルである。研究は、青から紫外の範囲の光にさらされたときに明るい緑色の蛍光を示す26.9 kDaのタンパク質である緑色蛍光タンパク質（GFP）でタグ付けされた組換えGABAARサブユニットの発現を示している。これにより、関連するインビトロおよびインビボの方法論の開発に不可欠な組換えタンパク質の形成が可能となる。GABAARサブユニットのうち、δサブユニットは、その細胞質ドメイン（第３膜貫通ドメインと第４膜貫通ドメインの間に見られる進化的に保存されたドメイン）にタグが付けられたことがなかった。本研究では、まず、GABAARのδ、α1、β2サブユニットをコードするマウスcDNAをクローニングし、細胞質ドメイン内のユニークな部位にGFPバリアントであるEGFP(enhanced GFP)をタグ付けしたδサブユニットの2つの融合タンパク質を開発した。組換えタンパク質は、単独で、またはα１および／またはβ２サブユニットと組み合わせて、神経芽腫２ａ細胞において発現させた。ライブセル共焦点顕微鏡により、神経芽腫2a細胞においてα1およびβ2サブユニットの存在下で発現した場合、細胞質的にタグ付けされたδサブユニットは細胞膜を標的としていることが示された。しかし、これらのサブユニットを単独で発現させた場合や、同一細胞株内でα1またはβ2サブユニットのみで発現させた場合には、この現象は観察されなかった。これらの結果は、文献中の他のin-vitro研究に記載されているGABAARサブタイプの一般的なオリゴマー化およびターゲティングパターンを確認するものである。したがって、我々の結果は、細胞質ドメイン内のEGFPタギングが組換えδサブユニットのオリゴマー化および細胞表面発現を阻害しないことを示唆している。我々の知る限りでは、δサブユニットの細胞質ドメインにタグ付けされたδ-GABAARsの生成、発現、および予備的な解析を示した最初の研究であり、δサブユニットを介したGABAARsの細胞内タンパク質相互作用をプローブするためにさらに改良することができます。

The γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) are heteropentameric chloride channels responsible for primary inhibition in the mammalian brain. Studies have shown the expression of recombinant GABAAR subunits tagged with the green fluorescent protein (GFP), a 26.9 kDa protein that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range. This allows the formation of recombinant proteins essential for the development of relevant in-vitro and in-vivo methodologies. Among the GABAAR subunits, the δ subunit was never tagged in its cytoplasmic domain, an evolutionary conserved domain found in between the third and the fourth transmembrane domains. In this study, first, we have cloned the mouse cDNAs encoding for the δ, α1, β2 subunits of GABAARs, and then developed two fusion proteins of δ subunit each tagged with the GFP variant, EGFP (enhanced GFP) at unique sites in the cytoplasmic domain. The recombinant proteins were expressed alone or in combination with α1 and/or β2 subunits in neuroblastoma 2a cells. Live cell confocal microscopy indicated that the cytoplasmically tagged δ subunits were targeted to the cell membrane when expressed in the presence of α1 and β2 subunits in neuroblastoma 2a cells. However, this was not observed when they were expressed alone or only with α1 or β2 subunits in the same cell line. These results confirm the general oligomerization and targeting pattern of GABAAR subtypes described in the other in-vitro studies in the literature. Thus, our results suggest that the EGFP tagging in the ctoplasmic domain did not interfere with the oligomerization and cell surface expression of recombinant δ subunits. To our knowledge, this is the first study showing the generation, expression and preliminary analysis of the δ-GABAARs tagged in the cytoplasmic domain of the δ subunit which can be further elaborated to probe intracellular protein interactions of GABAARs via the δ subunit.

© 2019 Oflaz et al. Published by IMR press.