秦嶺（中国）の腐った木材からのバイオマス分解のためのセルロース分解菌のスクリーニングとBacillus methylotrophicusからのセルラーゼのクローニング

Screening of cellulolytic bacteria from rotten wood of Qinling (China) for biomass degradation and cloning of cellulases from Bacillus methylotrophicus.

• Lingling Ma
• Yingying Lu
• Hong Yan
• Xin Wang
• Yanglei Yi
• Yuanyuan Shan
• Bianfang Liu
• Yuan Zhou
• Xin Lü

抄録

背景:

今後、化石エネルギーに代わるバイオエネルギーとして注目されているセルロース系バイオマス分解は、より注目されるべき分野であり、より評価の高いセルロース分解菌の単離は、この分野の基礎を築くことになるだろう。秦嶺山地は独特の生物多様性を有しており、注目すべき特性を有するセルロース分解菌の有望な供給源となっている。そこで、本研究の目的は、潜在的なセルロース分解菌を発見し、選抜された強力な菌からのセルラーゼのクローニングの可能性を検証することであった。

BACKGROUND: Cellulosic biomass degradation still needs to be paid more attentions as bioenergy is the most likely to replace fossil energy in the future, and more evaluable cellulolytic bacteria isolation will lay a foundation for this filed. Qinling Mountains have unique biodiversity, acting as promising source of cellulose-degrading bacteria exhibiting noteworthy properties. Therefore, the aim of this work was to find potential cellulolytic bacteria and verify the possibility of the cloning of cellulases from the selected powerful bacteria.

結果:

本研究では、秦嶺山地の腐朽木材から55種の潜在的なセルラーゼ菌をスクリーニングし、同定した。その結果、B. methylotrophicus 1EJ7が最も優勢な細菌であることが示唆され、腐朽木材中ではBacillusが主要なセルロース分解菌であることが示された。さらに、走査型電子顕微鏡（SEM）やX線回折法を用いたコムギワラのミクロモルフォロジーと結晶性の解析からも、有意な加水分解が確認された。セルラーゼβ-グルコシダーゼ（243 aa）とエンドグルカナーゼ（499 aa）をB. methylotrophicus 1EJ7から不均一にクローニングして発現させることに成功し、酵素活性はそれぞれ1670.15±18.94U/mL、0.130±0.002U/mLと良好なセルロース分解効果を示すことがわかった。また、アミノ酸配列の解析から、β-グルコシダーゼはGH16ファミリーに属し、エンドグルカナナーゼはGH5ファミリーの触媒ドメインとCBM3ファミリーの糖質結合モジュールから構成されていることが明らかになった。

RESULTS: In present study, 55 potential cellulolytic bacteria were screened and identified from the rotten wood of Qinling Mountains. Based on the investigation of cellulase activities and degradation effect on different cellulose substrates, Bacillus methylotrophicus 1EJ7, Bacillus subtilis 1AJ3 and Bacillus subtilis 3BJ4 were further applied to hydrolyze wheat straw, corn stover and switchgrass, and the results suggested that B. methylotrophicus 1EJ7 was the most preponderant bacterium, and which also indicated that Bacillus was the main cellulolytic bacteria in rotten wood. Furthermore, scanning electron microscopy (SEM) and X-ray diffraction analysis of micromorphology and crystallinity of wheat straw also verified the significant hydrolyzation. With ascertaining the target sequence of cellulase β-glucosidase (243 aa) and endoglucanase (499 aa) were successfully heterogeneously cloned and expressed from B. methylotrophicus 1EJ7, and which performed a good effect on cellulose degradation with enzyme activity of 1670.15 ± 18.94 U/mL and 0.130 ± 0.002 U/mL, respectively. In addition, based on analysis of amino acid sequence, it found that β-glucosidase were belonged to GH16 family, and endoglucanase was composed of GH5 family catalytic domain and a carbohydrate-binding module of CBM3 family.

結論:

秦嶺山地の腐朽木材から採取したセルロース分解菌のスクリーニング、同定、セルロース分解効果評価を行った結果、単離された菌株の中ではBacillusが優勢であり、セルロース分解においてはB. methylotrophicus 1EJ7が最も優れた性能を発揮することがわかった。また、B. methylotrophicus からβ-グルコシダーゼとエンドグルカナーゼを初めてクローニングして発現させることに成功し、セルロース分解の研究と産業界への応用に向けて、両菌株と組換え酵素の新たな材料を提供した。

CONCLUSIONS: Based on the screening, identification and cellulose degradation effect evaluation of cellulolytic bacteria from rotten wood of Qinling Mountains, it found that Bacillus were the predominant species among the isolated strains, and B. methylotrophicus 1EJ7 performed best on cellulose degradation. Meanwhile, the β-glucosidase and endoglucanase were successfully cloned and expressed from B. methylotrophicus for the first time, which provided new materials of both strain and the recombinant enzymes for the study of cellulose degradation and its application in industry.