Fyn遺伝子サイレンシングはERK1/2リン酸化を阻害してオリゴデンドロサイトのアポトーシスを減少させる

Fyn gene silencing reduces oligodendrocytes apoptosis through inhibiting ERK1/2 phosphorylation in epilepsy.

• Xinming Luo
• Zhengyu Li
• Jing Zhao
• Yan Deng
• Yuqin Zhong
• Ming Zhang

抄録

本研究では、てんかんモデルにおけるオリゴデンドロサイト(OL)のアポトーシスに及ぼす Fyn 遺伝子サイレンシングの影響とその機序を明らかにすることを目的とした。ラットから初代オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)を分離し、OLに分化させた。免疫蛍光標識により、OPCではA2B5が、OLではOlig2が陽性に発現しており、OPCとOLの分離に成功したことが示唆された。3種類のFyn siRNA（si-Fyn）とFyn siRNAネガティブコントロール（NC）をOLにトランスフェクションした。ウェスタンブロットの結果、3つのsi-Fynグループの中でsi-Fyn3が最も低いFyn発現を引き起こしたため、次の実験ではsi-Fyn3を選択した。細胞を４つのグループに分けた。コントロール、モデル、NC、si-Fynの4つのグループに分けた。Model群では、Mgフリーの細胞外液中で3時間培養した。コントロール細胞の形態は正常であった。しかし、モデル細胞では、神経細胞の遊走、細胞体の凝集、神経ネットワークの「格子状」の変化が観察された。様々なグループにおけるOLsのアポトーシスをフローサイトメトリーで評価した。様々なグループのOLsにおけるFyn、ERK1/2およびリン酸化ERK1/2（p-ERK1/2）の発現をウエスタンブロットにより評価した。コントロール群と比較して、モデル群およびNC群では、アポトーシス率、Fyn発現、およびp-ERK1/2/ERK1/2比が有意に増加した（<.05）。しかし、si-Fyn群のアポトーシス率、Fyn発現およびp-ERK1/2/ERK1/2比は、モデル群に比べて著しく小さくなっていた（<.05）。以上のことから、Fyn遺伝子サイレンシングはてんかんモデルにおけるERK1/2のリン酸化を抑制することでOLのアポトーシスを減少させることが示唆された。

This study aimed to investigate the effect of Fyn gene silencing on the apoptosis of oligodendrocytes (OLs) in epileptic model and the involved mechanism. Primary oligodendrocyte pro-genitor cells (OPCs) were separated from rats and differentiated to OLs. Immunofluorescent labeling showed positive expression of A2B5 in OPCs and Olig2 in OLs, suggesting the successful separation of OPCs and OLs. Three Fyn siRNAs (si-Fyn) and Fyn siRNA negative control (NC) were transfected into OLs. Western blot showed that among three si-Fyn groups, si-Fyn3 caused the lowest Fyn expression, so si-Fyn3 was chosen for following experiment. Cells were divided into four groups: Control, Model, NC and si-Fyn. In the Model group, cells were cultured in Mg-free extracellular fluid for 3 h. The morphology of control cells was normal. However, the migration of neurons, the aggregation of cell bodies and the "grid-like" changes of neural networks were observed in the model cells. OLs apoptosis in various groups was assessed by flow cytometry. Expression of Fyn, ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 (p-ERK1/2) in OLs of various groups was evaluated by western blot. Compared with the Control group, the apoptotic rates, the Fyn expression and p-ERK1/2/ERK1/2 ratio in the Model and NC groups increased significantly ( < .05). However, the apoptotic rate, the Fyn expression and p-ERK1/2/ERK1/2 ratio in the si-Fyn group were remarkably smaller than those in the Model group ( < .05). In conclusion, Fyn gene silencing reduced the apoptosis of OLs through inhibiting the phosphorylation of ERK1/2 in epileptic model.