液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法による全血溶解液中のアザチオプリン代謝物の高感度かつ迅速な定量

Highly sensitive and rapid determination of azathioprine metabolites in whole blood lysate by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

• Qiang Miao
• Yang-Juan Bai
• Jun-Long Zhang
• Yi Li
• Zhen-Zhen Su
• Lin Yan
• Lan-Lan Wang
• Yuan-Gao Zou

抄録

個別化治療では、薬物代謝の遺伝子検査を行い、初回投与量の情報を得て、その後の投与量を調整するための治療薬モニタリングを行います。その結果、毒性のある副作用を最小限に抑え、治療効果を最大限に高めることが期待されています。本研究では、全血溶解液中のアザチオプリンの2つの代謝物である6-チオグアニンヌクレオチド（6-TGN）と6-メチルメルカプトプリンリボシド（6-MMPr）を同時に定量するために、特異性、正確性、感度に優れた超高性能液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を開発しました。ジチオスレイトールの保護下にトリフルオロ酢酸で沈殿させ、6-MMPrと6-TGNを加水分解して6-メチルメルカプトプリンと6-チオグアニンを生成させた。クロマト分離は、Waters ACQUITY BEH C18(2.1×100mm、1.7μm)クロマトグラフィーカラムを用い、0.02mol/L酢酸アンモニウム緩衝液(0.3%ギ酸を含む)とアセトニトリルを用いて、0.4ml/minの流速でグラジエント溶出を行った。多重反応モニタリングモードのタンデム質量分析法を適用し、正イオン化モードのエレクトロスプレーイオン化源を介して検出した。分析時間は2分以内であった。各代謝物の検量線は、1.25～5000ng/ml（r>0.99）の最小二乗モデル（1/X）にフィットした。イオン対は、6-MMP m/z 167.07→152.15、6-TG m/z 168.06→134.13、および内部標準m/z 171.07→137.14として検出された。FDAのバイオ分析法バリデーションガイドラインの指導のもと、バリデーションを実施し、満足のいく結果を得ることができました。本法は、アザチオプリン維持療法を受けた65名の患者さんの各代謝物濃度のモニタリングに活用され、最適な結果を得ることができました。

Individualized therapy involves genetic test of drug metabolism, which provides information about the initial dose and therapeutic drug monitoring for adjusting the subsequent dose. Consequently, toxic side effects are expected to be minimized and therapeutic effects to be maximized. In this study, an ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method that was specific, accurate and sensitive was developed to simultaneously determine azathioprine two metabolites, 6-thioguanine nucleotides (6-TGN) and 6-methyl-mercaptopurine riboside (6-MMPr) in the whole blood lysate. We precipitated the sample by trifluoroacetic acid under the protection of dithiothreitol, with 6-MMPr and 6-TGN being hydrolyzed to produce 6-methymercaptopurine and 6-thioguanine. In the chromatographic separation, Waters ACQUITY BEH C18 (2.1 × 100 mm, 1.7 μm) chromatographic column was applied and gradient elution was conducted with 0.02 mol/L ammonium acetate buffer (which contains 0.3% formic acid) and acetonitrile at a flow rate of 0.4 ml/min. Tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring mode was applied for detection via electrospray ionization source in positive ionization mode. The analyzing process lasted for no more than 2 min. The calibration curve for each metabolite fitted a least squares model (weighed 1/X) from 1.25 to 5000 ng/ml (r > 0.99). The ion pairs were detected as 6-MMP m/z 167.07 → 152.15, 6-TG m/z 168.06 → 134.13, and internal standard m/z 171.07 → 137.14. Under the guidance of FDA guidelines for bioanalytical method validation, we carried out validation and obtained satisfactory results. The method was successfully utilized for monitoring the concentrations of each metabolite from 65 affected patients who had received azathioprine maintenance therapy and achieved optimal results.

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