シミアンウイルス40大型T抗原の発現による形質転換ヤギ初代細胞の樹立と特徴付け

Establishment and characterization of transformed goat primary cells by expression of simian virus 40 large T antigen for orf virus propagations.

• Yumiko Yamada
• Guan-Ru Liao
• Ching-Yu Tseng
• Yeu-Yang Tseng
• Wei-Li Hsu

抄録

ORFウイルス（ORFV）の宿主範囲が限られているため、野生型ORFVの単離および増殖には、ヤギやヒツジなどの自然宿主由来の初代細胞を用いることが推奨されている。このような状況では、初代細胞は数個の通過をサポートするだけなので、ＯＲＦＶ感染中のウイルス-宿主相互作用の研究のための選択肢が限られてしまう。SV40 T抗原は、細胞の寿命を延ばすために、複製性の老化を無効にすることができるウイルスのオンコプロテインである。本研究では、SV40 T抗原をレンチウイルス技術を用いて安定的に発現させることにより、ヤギ初代細胞である線維芽細胞(FB)と精巣細胞(GT)の2つの細胞の形質転換を達成した。SV40 T 抗原をコードする遺伝子の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびウエスタンブロット解析により確認された。免疫蛍光顕微鏡で観察したところ、SV40 T 抗原を発現する 2 種類の細胞（すなわち、FBT と GTT）は均質に精製されていた。さらに、FBTとGTTでは、同等の親細胞と比較して、成長速度が速く、血清依存性が低いことが明らかになった。FBTとGTTは、異なるプロファイルにもかかわらず、寛容性を維持し、ORFVのプラークを形成することができた。最も重要なことは、ヤギＦＢＴおよびＧＴＴの長寿命は、現場からのＯＲＦＶの分離、ＯＲＦＶの病原性の研究、および効率的なワクチン開発のための理想的な細胞培養資源として機能します。

Due to the limited host range of orf virus (ORFV), primary cells derived from its natural hosts, such as goats and sheep, are recommended for isolation and propagation of wild type ORFV. This situation limits the option for the study of virus-host interaction during ORFV infection since primary cells only support a few numbers of passages. SV40 T antigen is a viral oncoprotein that can abrogate replicative senescence, leading to an extended life span of cells. In this study, the transformation of two goat primary cells, fibroblast (FB) and testis (GT) cells, were achieved by stably expressing SV40 T antigen using the lentiviral technique. The presence of the gene encoding SV40 T antigen was validated by polymerase chain reaction (PCR) and western blot analyses. As evidenced by immunofluorescent microscopy, the two types of cells expressing SV40 T antigen (namely, FBT and GTT) were purified to homogeneity. Moreover, faster growth kinetics and a lower serum dependency were noticed in FBT and GTT, as compared with their counterpart parental cells. FBT and GTT remain permissive and can form plaque of ORFV, despite with different profiles; generally speaking, with SV40 T expression, ORFV forms plaques with smaller size and distinct margin. Most importantly, the prolonged life span of goat FBT and GTT serves as an ideal cell culture resource for ORFV isolation from the field, studies of ORFV pathogenesis and efficient vaccine development.