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単一粒子低温電子顕微鏡によるGPCRシグナル伝達複合体の構造研究のための"プラグアンドプレイ"フィデューシャルマークの開発
Development of "Plug and Play" Fiducial Marks for Structural Studies of GPCR Signaling Complexes by Single-Particle Cryo-EM.
PMID: 31669042 PMCID: PMC7297049. DOI: 10.1016/j.str.2019.10.004.
抄録
"普遍的な」合成抗体（sAB）ベースのフィデューシャルマークは、単粒子低温電子顕微鏡（SP cryo-EM）による G タンパク質共役型受容体（GPCR）シグナル伝達複合体の迅速な構造決定を容易にするために、カスタマイズされたファージ表示選択によって生成されました。sAB は、2 つの主要な G タンパク質サブクラス：三量体 G および G、ならびに mini-G に対して生成され、それらのコグニート GPCR のコンテキストで確実に結合するように試験されました。エピトープビニングは、各G(αβγ)タンパク質に対して複数の異なるエピトープが存在することを明らかにした。また、3量体のGとGの間で交差反応性を持ついくつかのGβγ特異的なsABが同定され、それらが「プラグアンドプレイ」の方法ですべてのサブクラスに渡って使用できることが示唆された。EMデータから、サブクラス特異的なsABは、複数のGPCRシグナル伝達複合体に対して有効なシングルおよびデュアルフィデューシャルを提供することが示唆された。
"Universal" synthetic antibody (sAB)-based fiducial marks have been generated by customized phage display selections to facilitate the rapid structure determination of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes by single-particle cryo-electron microscopy (SP cryo-EM). sABs were generated to the two major G protein subclasses: trimeric G and G, as well as mini-G, and were tested to ensure binding in the context of their cognate GPCRs. Epitope binning revealed that multiple distinct epitopes exist for each G(αβγ) protein. Several Gβγ-specific sABs, cross-reactive between trimeric G and G, were identified suggesting they could be used across all subclasses in a "plug and play" fashion. sABs were also generated to a representative of another class of GPCR signaling partner, G protein receptor kinase 1 (GRK1) and evaluated further, supporting the generalizability of the approach. EM data suggested that the subclass-specific sABs provide effective single and dual fiducials for multiple GPCR signaling complexes.
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