膜特異的スピントラップ、5-ドデシルカルバモイル-5-N-ドデシルアセトアミド-1-ピロリン-N-オキシド（diCPO）：理論、生物学的蛍光イメージングおよびEPR研究

Membrane-specific spin trap, 5-dodecylcarbamoyl-5-N-dodecylacetamide-1-pyroline-N-oxide (diCPO): theoretical, bioorthogonal fluorescence imaging and EPR studies.

• Colwyn A Headley
• Claire N Hoffman
• Juliana M Freisen
• Yongbin Han
• Joseph M Macklin
• Jay L Zweier
• Antal Rockenbauer
• Jeff Kuret
• Frederick A Villamena

抄録

膜状小器官は、内因性の活性酸素および窒素種の主要な供給源である。これらの活性種が高レベルで存在すると、高分子の損傷や疾患を引き起こす可能性があります。そこで我々は、ニトロンスピントラップが細胞内膜を選択的に標的とすることができるかどうかを、生体直交イメージング法を用いて検討した。電子常磁性共鳴イメージングにより、5-ドデシルカルバモイル-5-N-ドデシルアセトアミド-1-ピロリン-N-オキシド（diCPO）を用いて、ホスファチジルコリンで構成されるリポソームへのニトロンスピントラップの標的化が可能であることを明らかにした。生細胞内での局在性を確認するために、ひずみ促進アルキン-ニトロン環化付加反応(SPANC)を用いてフルオロフォアを導入した。2種類のフルオロフォア共役アルキンを研究した：ヘキシン-フルオレセイン(HYA-FL)とジベンジルシクロオクチン-PEG4-5/6-スルフォルホダミンB(DBCO-Rhod)。計算及び質量分析実験により、DBCO-Rhod(HYA-FLは含まない)とdiCPOとの環化付加体形成が無細胞溶液中で確認された。また、diCPOとDBCO-Rhodで処理したウシ大動脈内皮細胞を共焦点顕微鏡で観察したところ、細胞内膜に蛍光が局在していることが明らかになった。これらの結果は、ニトロンスピントラップの細胞膜へのターゲティングが可能であることを示しており、生物学的アプローチが細胞内コンパートメント化特性の解明に役立つことを示している。

Membranous organelles are major endogenous sources of reactive oxygen and nitrogen species. When present at high levels, these species can cause macromolecular damage and disease. To better detect and scavenge free radical forms of the reactive species at their sources, we investigated whether nitrone spin traps could be selectively targeted to intracellular membranes using a bioorthogonal imaging approach. Electron paramagnetic resonance imaging demonstrated that the novel cyclic nitrone 5-dodecylcarbamoyl-5-N-dodecylacetamide-1-pyroline-N-oxide (diCPO) could be used to target the nitrone moiety to liposomes composed of phosphatidyl choline. To test localization with authentic membranes in living cells, fluorophores were introduced via strain-promoted alkyne-nitrone cycloaddition (SPANC). Two fluorophore-conjugated alkynes were investigated: hexynamide-fluoresceine (HYA-FL) and dibenzylcyclooctyne-PEG4-5/6-sulforhodamine B (DBCO-Rhod). Computational and mass spectrometry experiments confirmed the cycloadduct formation of DBCO-Rhod (but not HYA-FL) with diCPO in cell-free solution. Confocal microscopy of bovine aortic endothelial cells treated sequentially with diCPO and DBCO-Rhod demonstrated clear localization of fluorescence with intracellular membranes. These results indicate that targeting of nitrone spin traps to cellular membranes is feasible, and that a bioorthogonal approach can aid the interrogation of their intracellular compartmentalization properties.