HIV-1プロウイルスの遺伝的適合性をマップするCRISPR/Cas9ライブラリ

A CRISPR/Cas9 library to map the HIV-1 provirus genetic fitness.

• K E Yoder

抄録

統合されたプロウイルスゲノムは、HIV-1感染症の治療への大きな障壁となっている。CRISPR/Cas9などのゲノム編集技術は、ウイルスゲノム内の配列特異的な部位にDNA二本鎖切断を導入することにより、HIV-1プロウイルスを無効化または除去することができる。エラーを起こしやすい非相同末端接合経路による宿主のＤＮＡ修復は、その切断部位に突然変異原性の挿入または欠失を発生させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集は、細胞培養において複製能力のあるウイルスゲノムを減少させることが示されているが、ゲノム編集の可能性のあるターゲットのうちの少数のターゲットのみがアッセイされている。現在のところ、HIV-1の二本鎖切断の遺伝的適合性のマップは存在せず、編集ターゲットの選択を示唆するものではない。しかし、CRISPR/Cas9ゲノム編集により、プロウイルスの長さに沿って二本鎖切断を標的とした二本鎖切断遺伝的適合性マップを生成することが可能となった。我々は、CRISPR/Cas9の異なる細菌種を用いて、すべての可能性のあるHIV-1ターゲットを同定した。このガイドRNAのライブラリーを、GC含有量およびヒトゲノム中の潜在的なオフターゲット部位について評価した。ライブラリーの複雑さは、HIV-1長末端リピートの重複ガイドRNAターゲットとenv遺伝子内のターゲットを除去することで低減された。HIV-1ゲノムはATリッチであるが、プロトスペーサー隣接モチーフNGGを持つS. pyogenes CRISPR/Cas9は、最も多くのHIV-1ガイドRNAを提供している。このHIV-1ガイドRNAのライブラリは、二本鎖切断遺伝的脆弱性マップを生成するために使用することができ、HIV-1プロウイルスのために設計されたあらゆるゲノム編集技術にさらに適用することができます。キーワードHIV-1; ゲノム編集; CRISPR; 遺伝子適合性; ガイドRNA

The integrated proviral genome is the major barrier to a cure for HIV-1 infection. Genome editing technologies, such as CRISPR/Cas9, may disable or remove the HIV-1 provirus by introducing DNA double strand breaks at sequence specific sites in the viral genome. Host DNA repair by the error-prone non-homologous end joining pathway generates mutagenic insertions or deletions at the break. CRISPR/Cas9 editing has been shown to reduce replication competent viral genomes in cell culture, but only a minority of possible genome editing targets have been assayed. Currently there is no map of double strand break genetic fitness for HIV-1 to inform the choice of editing targets. However, CRISPR/Cas9 genome editing makes it possible to target double strand breaks along the length of the provirus to generate a double strand break genetic fitness map. We identified all possible HIV-1 targets with different bacterial species of CRISPR/Cas9. This library of guide RNAs was evaluated for GC content and potential off-target sites in the human genome. Complexity of the library was reduced by eliminating duplicate guide RNA targets in the HIV-1 long terminal repeats and targets in the env gene. Although the HIV-1 genome is AT-rich, the S. pyogenes CRISPR/Cas9 with the proto-spacer adjacent motif NGG offers the most HIV-1 guide RNAs. This library of HIV-1 guide RNAs may be used to generate a double strand break genetic fragility map to be further applied to any genome editing technology designed for the HIV-1 provirus. Keywords: HIV-1; genome editing; CRISPR; genetic fitness; guide RNAs.