セルピンペプチダーゼ阻害剤B2(SERPINB2)の発現は、アリール炭化水素受容体(AhR)によって制御されている

Expression of Serpin Peptidase Inhibitor B2 (SERPINB2) is regulated by Aryl hydrocarbon receptor (AhR).

• Damian Brauze
• Katarzyna Kiwerska
• Kinga Bednarek
• Reidar Grenman
• Joanna Janiszewska
• Maciej Giefing
• Malgorzata Jarmuz-Szymczak

抄録

アリール炭化水素受容体（AhR）は、β-ナフトフラボン（BNF）、ベンゾ[a]ピレン（BaP）、ダイオキシン（TCDD）などの芳香族平面化合物に高い親和性を持つ、保存性の高いリガンド活性化転写因子である。リガンドに結合した後、AhRは、第1相および第2相の薬物代謝遺伝子の発現誘導を誘発し、また、外来物質の代謝に直接関与していない他の多数の遺伝子の発現も誘発する。いくつかの研究で、AhRが腫瘍の発生、促進、進行に関与していることが示されているが、これらのプロセスに関与する分子機構は完全には解明されていない。我々の研究室で行われた先行研究では、SERPINB2遺伝子がAhRによって制御されていると考えられることが示された。このような誘導が本当にAhRに依存していることを証明するために、本研究では喉頭扁平上皮癌細胞株(UT-SCC-34)にshRNAを安定的にトランスフェクションすることでAhRの発現をノックダウンし、その結果、BNFによって誘導されるSERPINB2の発現を92%減少させることができた。しかし、インシリコ解析の結果、SERPINB2遺伝子のプロモーター内にAhR依存性の応答性エレメントが存在することは明らかになっていなかった。そこで、この問題に対処するために、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを用いたところ、BNFによるSERPINB2発現のAhR依存的誘導には、新たに合成されたタンパク質が関与していることが明らかになった。そこで、AhRがSERPINB2遺伝子の上流に局在していると考えられるXRE（Xenobiotic-responsive element）に結合していることを除外するために、クロマチン免疫沈降アッセイを行った。予想通り、SERPINB2遺伝子近傍ではAhRとその応答エレメントとの直接的な結合は見られず、AhRによる間接的なSERPINB2誘導が実証された。しかしながら、さらなる解析により、SERPINB2遺伝子の上流20kbpのDNA領域でコードされるエンハンサーRNAの発現はAhR依存性であることが明らかになった。AhRを介したSERPINB2誘導は明らかにタンパク質の合成を必要とするが、SERPINB2誘導の速度はCYP1A1およびCYP1B1誘導の速度（いずれもAhRによって直接制御される遺伝子）と同程度の速度である。したがって、細菌性リポ多糖類（LPS）によるSERPINB2発現誘導に関する先行研究を考えると、同様に、ポーズ解除タンパク質との相互作用がSERPINB2発現のAhR依存性制御に関与していると考えられる。

Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a highly conserved ligand-activated transcription factor with high affinity to aromatic planar compounds, such as β-naphthoflavone (BNF), benzo[a]pyrene (BaP) or dioxin (TCDD). After binding the ligand, AhR triggers induction of the expression of phase I and phase II drug-metabolizing genes, together with numerous other genes that are not directly involved in the metabolism of xenobiotics. Several studies have shown that AhR plays a role in tumor initiation, promotion and progression, but the molecular mechanisms involved in these processes are not fully understood. A previous study from our laboratory indicated that the SERPINB2 gene is presumably regulated by AhR. To prove that such induction is really AhR-dependent, in the present study we knocked down the expression of AhR by stable transfection of a laryngeal squamous cell carcinoma cell line (UT-SCC-34) with shRNA, resulting in 92% reduction of BNF-induced expression of SERPINB2. However, in silico analysis did not reveal AhR-dependent responsive elements in the promoter of the SERPINB2 gene. Therefore, to address this problem, we have used cycloheximide, an inhibitor of translation, and our results clearly indicate that an additional, newly synthesized protein is involved in AhR-dependent induction of SERPINB2 expression by BNF. So, to exclude that AhR binds to the putative xenobiotic-responsive elements (XREs) localized upstream of the SERPINB2 gene, we performed chromatin immunoprecipitation assays. As expected, we found no direct binding of AhR to its responsive elements in the vicinity of the SERPINB2 gene, further demonstrating the indirect SERPINB2 induction by AhR. However, the further analysis demonstrated that the expression of the enhancer RNA encoded by the region of DNA 20 kbp upstream from the SERPINB2 gene was AhR-dependent. Although AhR-mediated SERPINB2 induction clearly requires the synthesis of an additional protein, the kinetics of SERPINB2 induction is as fast as the kinetics of CYP1A1 and CYP1B1 induction (both genes directly regulated by AhR). Therefore, given previous studies regarding the induction of SERPINB2 expression by bacterial lipopolysaccharides (LPS), we think that, similarly, the interaction with pause-release proteins may be responsible for AhR-dependent regulation of SERPINB2 expression.

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