線維芽細胞増殖因子-2とA83-01を併用したインビトロ培養による前処理によるヒト歯根膜幹細胞の生物学的挙動の最適化

The biological behavior optimization of human periodontal ligament stem cells via preconditioning by the combined application of fibroblast growth factor-2 and A83-01 in in vitro culture expansion.

• Chunshu Zhang
• Hongmei Guo
• Chengzhe Yang
• Qian Chen
• Jiahui Huang
• Lianlian Liu
• Yu Zhang
• Shanshan Jin
• Aimei Song
• Pishan Yang

抄録

背景:

歯周組織工学における最適な種細胞の供給源として、歯根膜幹細胞（PDLSCs）は、その限られた資源とin vitro培養での自然分化のため、細胞の増殖を改善するために常に研究されてきた。線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）は、培養液に添加することで骨髄間葉系幹細胞（BMMSCs）の増殖を促進し、多能性を維持することが証明されている。また、A83-01は、トランスフォーミンググロースファクターβ受容体（TGF-βR）の低分子阻害剤として、細胞増殖を促進することが知られている。そこで、本研究の目的は、FGF-2 と A83-01 の併用により、in vitro 培養中の細胞の量と質を向上させることができるかどうかを検証することであった。

BACKGROUND: As the optimal source of seed cells in periodontal tissue engineering, periodontal ligament stem cells (PDLSCs) have always been researched to improve cell expansion due to their limited resource and spontaneous differentiation in vitro cultivation. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) has been proven to stimulate bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) proliferation and maintain their pluripotency when being added to the culture medium. As a small molecule inhibitor of transforming growth factor-beta receptors (TGF-βRs), A83-01 can also promote cell proliferation. Therefore, the aim of this study was to verify whether the combined application of FGF-2 and A83-01 could augment cell quantity and quality during in vitro culture.

方法:

PDLSCをA83-01、FGF-2、またはそれらの組み合わせで前処理した。細胞計数キット8（CCK8）アッセイ、細胞アポトーシスアッセイ、ALP活性アッセイ、アリザリンレッドS染色アッセイ、RT-PCRアッセイ、ウェスタンブロットアッセイおよびELISAを用いて、PDLSCの増殖、アポトーシス、幹細胞性、骨形成分化およびパラクリ ン作用に対する異なる前処理戦略の持続的効果を測定した。

METHODS: PDLSCs were preconditioned with A83-01, FGF-2, or their combination. A cell counting kit-8 (CCK8) assay, cell apoptosis assay, ALP activity assay, Alizarin Red S staining assay, RT-PCR assay, Western blot assay and ELISA were used to determine the sustained effects of different preconditioning strategies on the proliferation, apoptosis, stemness, osteogenic differentiation and paracrine action of PDLSCs.

結果:

FGF-2 と A83-01 の併用は、対照と比較して、PDLSCs の細胞増殖、アポトーシスの減少、幹細胞発現の拡大、後の骨形成分化とミネラル化の促進、パラクリ ン作用の増加を有意に示した。さらに、この組み合わせはFGF-2単独と比較して、増殖、幹細胞発現、パラクリ ン作用を増強する上で有意な優位性を示した。

RESULTS: The combined application of FGF-2 and A83-01 significantly augmented cell expansion, reduced cell apoptosis, magnified stemness expression, promoted later osteogenic differentiation and mineralization and increased paracrine action of PDLSCs compared with the control. Moreover, the combination presented significant advantages in enhancing proliferation, stemness expression and paracrine action over FGF-2 alone.

結論:

A83-01とFGF-2の併用は、培養拡大におけるPDLSCの生物学的挙動の最適化のための改善戦略であり、FGF-2単独よりも増殖、幹細胞発現、サイトカイン分泌の強化に有利であると考えられます。

CONCLUSIONS: The combined application of A83-01 and FGF-2 may be an improved strategy for PDLSCs biological behavior optimization in culture expansion and advantageous for reinforcing proliferation, stemness expression and cytokine secretion over FGF-2 alone.