スフィンゴビウム属細菌TCM1由来ホスホトリエステラーゼ触媒反応の遷移状態解析

Transition State Analysis of the Reaction Catalyzed by the Phosphotriesterase from Sphingobium sp. TCM1.

• Andrew N Bigley
• Dao Feng Xiang
• Tamari Narindoshvili
• Charlie W Burgert
• Alvan C Hengge
• Frank M Raushel

抄録

有機リン系難燃剤は、ほぼすべての耐久性プラスチック製品に使用されている安定した有毒化合物であり、主要な新興汚染物質と考えられています。Sphingobium sp. TCM1（Sb-PTE）からのホスホトリエステラーゼは、トリフェニルリン酸塩およびトリス（2-クロロエチル）リン酸塩のような有機リン系難燃剤を加水分解できることが知られている数少ない酵素の一つです。これらの有機リン酸塩の加水分解に対するSb-PTEの有効性は、中心のリンコアから不活性化されたアルキルおよびフェノールエステルを加水分解する能力から生じるようである。Sb-PTEがどのようにして不活性化された置換基の加水分解を触媒することができるかは知られていない。Sb-PTEの触媒的加水分解機構を調べるために、反応のpH依存性と溶媒の粘度変化の効果を測定した。これらの実験は、基質の加水分解に対する一次及び二次的な18-酸素同位体効果の測定と、加水分解の速度定数の大きさに対する離脱基のp Kの変化の効果の決定によって補完された。これらの結果から、求核性攻撃には単一の基がイオン化されていなければならず、離脱基のプロトン化には別の一般酸が関与していないことが示唆された。また、Brønsted分析と重原子の動力学的同位体効果は、初期の連想遷移状態と一致し、その後のプロトン移動は速度制限的なものではないことがわかった。基質の二核金属中心への新規な結合モードと触媒機構により、有機リン酸基質からの未活性エステルを加水分解するSb-PTEの特異な能力を説明することが提案された。

Organophosphorus flame retardants are stable toxic compounds used in nearly all durable plastic products and are considered major emerging pollutants. The phosphotriesterase from Sphingobium sp. TCM1 ( Sb-PTE) is one of the few enzymes known to be able to hydrolyze organophosphorus flame retardants such as triphenyl phosphate and tris(2-chloroethyl) phosphate. The effectiveness of Sb-PTE for the hydrolysis of these organophosphates appears to arise from its ability to hydrolyze unactivated alkyl and phenolic esters from the central phosphorus core. How Sb-PTE is able to catalyze the hydrolysis of the unactivated substituents is not known. To interrogate the catalytic hydrolysis mechanism of Sb-PTE, the pH dependence of the reaction and the effects of changing the solvent viscosity were determined. These experiments were complemented by measurement of the primary and secondary 18-oxygen isotope effects on substrate hydrolysis and a determination of the effects of changing the p K of the leaving group on the magnitude of the rate constants for hydrolysis. Collectively, the results indicated that a single group must be ionized for nucleophilic attack and that a separate general acid is not involved in protonation of the leaving group. The Brønsted analysis and the heavy atom kinetic isotope effects are consistent with an early associative transition state with subsequent proton transfers not being rate limiting. A novel binding mode of the substrate to the binuclear metal center and a catalytic mechanism are proposed to explain the unusual ability of Sb-PTE to hydrolyze unactivated esters from a wide range of organophosphate substrates.