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直交するリボソームサブユニットの相互作用を制御することで、新たな機能の進化を可能にする
Controlling orthogonal ribosome subunit interactions enables evolution of new function.
PMID: 30518861 PMCID: PMC6525102. DOI: 10.1038/s41586-018-0773-z.
抄録
直交リボソームは、大腸菌において、スモールサブユニットの16SリボソームRNAの改変版を介して、直交メッセンジャーRNAに向けられた不自然なリボソームである。直交リボソームの誘導進化は、新しいリボソーム機能へのアクセスを提供し、進化した直交リボソームは、複数の非カノニカルアミノ酸をタンパク質にエンコードすることを可能にしました。元々の直交リボソームは、ラージサブユニットに含まれる23SリボソームRNAのプールを内因性リボソームと共有していました。直交する16SrRNAと23S rRNAの関連を制御することで、新しい23S rRNAを直交するmRNAに選択的に誘導することができれば、ラージサブユニットの新しい機能の進化が可能になると考えられる。これまでの研究では、直交する16S rRNAと環状にパーミュレートされた23S rRNAを共有結合させ、活性の低い直交リボソームを作製していたが、これらのリボソームでは、結合したサブユニットは互いに特異的に結合せず、内在するサブユニットと結合して翻訳を仲介していた。ここで我々は、親の直交リボソームと同等の活性を持つ直交「ステープル付き」リボソーム（最適化されたRNAステープルを介してサブユニットが連結されている）を発見した；これらのリボソームは、内因性サブユニットとの関連付けを最小限に抑え、ステープル付きサブユニットの関連付けを介して直交mRNAの翻訳を媒介する。我々は、ゲノムにコードされたステープルリボソームを唯一のリボソームとして持つ細胞を進化させ、天然のリボソームと同様の速度で細胞の成長をサポートしている。さらに、3.0Åの低温電子顕微鏡を用いて、操作されたステープル付きリボソームの構造を可視化し、ステープルがどのようにサブユニットを連結し、それらの結合を制御しているかを明らかにした。本研究では、天然のリボソームが本質的に翻訳できないモノマーの配列を効率的に重合させる直交ステープルリボソームを進化させることで、サブユニットの結合を制御することの有用性を実証した。本研究は、直交リボソーム全体のrRNAを進化させ、非カノニカルな生物学的ポリマーをコード化した細胞内合成を可能にする基盤を提供するものである。
Orthogonal ribosomes are unnatural ribosomes that are directed towards orthogonal messenger RNAs in Escherichia coli, through an altered version of the 16S ribosomal RNA of the small subunit. Directed evolution of orthogonal ribosomes has provided access to new ribosomal function, and the evolved orthogonal ribosomes have enabled the encoding of multiple non-canonical amino acids into proteins. The original orthogonal ribosomes shared the pool of 23S ribosomal RNAs, contained in the large subunit, with endogenous ribosomes. Selectively directing a new 23S rRNA to an orthogonal mRNA, by controlling the association between the orthogonal 16S rRNAs and 23S rRNAs, would enable the evolution of new function in the large subunit. Previous work covalently linked orthogonal 16S rRNA and a circularly permuted 23S rRNA to create orthogonal ribosomes with low activity; however, the linked subunits in these ribosomes do not associate specifically with each other, and mediate translation by associating with endogenous subunits. Here we discover engineered orthogonal 'stapled' ribosomes (with subunits linked through an optimized RNA staple) with activities comparable to that of the parent orthogonal ribosome; they minimize association with endogenous subunits and mediate translation of orthogonal mRNAs through the association of stapled subunits. We evolve cells with genomically encoded stapled ribosomes as the sole ribosomes, which support cellular growth at similar rates to natural ribosomes. Moreover, we visualize the engineered stapled ribosome structure by cryo-electron microscopy at 3.0 Å, revealing how the staple links the subunits and controls their association. We demonstrate the utility of controlling subunit association by evolving orthogonal stapled ribosomes which efficiently polymerize a sequence of monomers that the natural ribosome is intrinsically unable to translate. Our work provides a foundation for evolving the rRNA of the entire orthogonal ribosome for the encoded cellular synthesis of non-canonical biological polymers.