インフルエンザA M2プロトンチャネルのランダム突然変異解析により、新しい耐性変異体が発見された

Random Mutagenesis Analysis of the Influenza A M2 Proton Channel Reveals Novel Resistance Mutants.

• Paul Santner
• João Miguel da Silva Martins
• Caroline Kampmeyer
• Rasmus Hartmann-Petersen
• Jonas S Laursen
• Amelie Stein
• Christian A Olsen
• Isaiah T Arkin
• Jakob R Winther
• Martin Willemoës
• Kresten Lindorff-Larsen

抄録

インフルエンザM2プロトンチャネルは主要な薬剤標的であるが、残念ながら耐性変異の獲得により、インフルエンザ治療における薬剤の機能寿命が大きく低下する。そうでなければ初期のアダマンチン系薬剤に耐性を持つ変異型M2チャネルを阻害する新しいM2阻害剤が報告されているが、そのような阻害剤に対して耐性が発生しやすいかどうか、またどのようにして耐性が発生しやすいかについては不明な点が残っている。我々は、新たに開発されたプロトン伝導アッセイと、大腸菌ベースの選択とスクリーニングのための確立された方法を組み合わせて、M2の機能と阻害の研究を可能にした。このプラットフォームを構造的に異なるM2阻害剤の2つのグループと組み合わせることで、変異体ライブラリーから薬剤耐性M2チャネルを単離することができました。この解析から、2つのM2変異体のグループが出現しました。最初のグループは、インヒビターの影響をほとんど受けずに現れた、M_089（N13I、I35L、およびF47L）およびM_272（G16CおよびD44H）、およびこれらに由来する一置換変異体（I35L、L43P、D44H、およびL46P）であった。機能的には、これらは、既知の薬剤耐性Ｍ２チャネルＶ２７Ａ、Ｓ３１Ｎ、および豚インフルエンザに類似している。さらに、試験したM2変異体の第二のグループは、すべて薬剤によって依然として阻害されていたが、野生型M2よりも少ない程度であった。分子動力学シミュレーションは、シミュレーション中にリガンドが急速に複合体から解離した薬剤耐性グループとは対照的に、野生型と耐性の低いM2グループへの薬剤結合は、リガンドの安定した位置を示した2つのグループを区別するのに役立ちました。

The influenza M2 proton channel is a major drug target, but unfortunately, the acquisition of resistance mutations greatly reduces the functional life span of a drug in influenza treatment. New M2 inhibitors that inhibit mutant M2 channels otherwise resistant to the early adamantine-based drugs have been reported, but it remains unclear whether and how easy resistance could arise to such inhibitors. We have combined a newly developed proton conduction assay with an established method for selection and screening, both Escherichia coli-based, to enable the study of M2 function and inhibition. Combining this platform with two groups of structurally different M2 inhibitors allowed us to isolate drug resistant M2 channels from a mutant library. Two groups of M2 variants emerged from this analysis. A first group appeared almost unaffected by the inhibitor, M_089 (N13I, I35L, and F47L) and M_272 (G16C and D44H), and the single-substitution variants derived from these (I35L, L43P, D44H, and L46P). Functionally, these resemble the known drug resistant M2 channels V27A, S31N, and swine flu. In addition, a second group of tested M2 variants were all still inhibited by drugs but to a lesser extent than wild type M2. Molecular dynamics simulations aided in distinguishing the two groups where drug binding to the wild type and the less resistant M2 group showed a stable positioning of the ligand in the canonical binding pose, as opposed to the drug resistant group in which the ligand rapidly dissociated from the complex during the simulations.