標的再配列を用いた馬のコラーゲン性レクチンの遺伝的変異の同定

Identification of genetic variation in equine collagenous lectins using targeted resequencing.

• Russell S Fraser
• Luis G Arroyo
• Ann Meyer
• Brandon N Lillie

抄録

コラーゲン性レクチンは、感染症に対する自然免疫抵抗性において重要な役割を果たす可溶性パターン認識受容体の一群である。病原体表面の炭水化物モチーフの認識を介して、いくつかのコラーゲン性レクチンは補体のレクチン経路を活性化し、宿主防御の有効な手段を提供することができる。膠原性レクチンの遺伝子多型は、いくつかの種において、動物が様々な感染症に罹患する素因となることが示されています。感染症は馬の罹患率の重要な原因であるが、馬の膠原性レクチンの役割についてはほとんど知られていない。ハイスループット標的再配列法を用いて、馬の膠原性レクチン遺伝子の遺伝的変異と疾患感受性の関係を調べた。死後検査のために提出された馬の組織からDNAを分離した。動物を感染性疾患や自己炎症性疾患を持つ馬（n=37）と持たない馬（n=52）の2つの集団に分け、優性病理学的プロセスによって細分化し、4～5頭の馬を含む合計21のプールを作成した。各馬からＤＮＡを抽出し、等モル量でプールし、１１頭の馬コラーゲンレクチン遺伝子および関連するＭＡＳＰ遺伝子のエクソン、イントロン、上流（約５０ｋｂ）および下流（約３ｋｂ）の調節領域を再配列のために標的化した。カスタムターゲットキャプチャーキットを用いてシークエンシングライブラリーを調製し、Illumina MiSeqでシークエンシングした。品質管理フィルターを実施した後、4559個のバリアントが同定された。そのうち、コード領域に92個（ミスセンス43個、ナンセンス1個、同義語48個）、イントロンに1414個、上流領域に3029個、下流領域に240個が存在していた。ミセンスショートヌクレオチドバリアントのインシリコ解析により、コラーゲンレクチンタンパク質の構造または機能を破壊する可能性のある12の変異、予測される転写因子結合部位内に位置する280の変異、予測されるマイクロRNA結合要素内に位置する95の変異が同定された。対立遺伝子の関連性を解析した結果、113個の突然変異が感染性/自己炎症性集団と非感染性集団の間で分離していることが確認された。この実験で発見された変異は、馬の病気のかかりやすさに影響を与える可能性のある遺伝的要因であり、さらなる集団レベルのジェノタイピングの候補となるであろう。この研究は、プールされたハイスループットシーケンシングが費用対効果の高いバリアント発見のための実行可能な戦略であることを示す証拠が増えつつあることに貢献している。

Collagenous lectins are a family of soluble pattern recognition receptors that play an important role in innate immune resistance to infectious disease. Through recognition of carbohydrate motifs on the surface of pathogens, some collagenous lectins can activate the lectin pathway of complement, providing an effective means of host defense. Genetic polymorphisms in collagenous lectins have been shown in several species to predispose animals to a variety of infectious diseases. Infectious diseases are an important cause of morbidity in horses, however little is known regarding the role of equine collagenous lectins. Using a high-throughput, targeted re-sequencing approach, the relationship between genetic variation in equine collagenous lectin genes and susceptibility to disease was investigated. DNA was isolated from tissues obtained from horses submitted for post-mortem examination. Animals were divided into two populations, those with infectious or autoinflammatory diseases (n = 37) and those without (n = 52), and then subdivided by dominant pathological process for a total of 21 pools, each containing 4-5 horses. DNA was extracted from each horse and pooled in equimolar amounts, and the exons, introns, upstream (approximately 50 kb) and downstream (approximately 3 kb) regulatory regions for the 11 equine collagenous lectin genes and related MASP genes were targeted for re-sequencing. A custom target capture kit was used to prepare a sequencing library, which was sequenced on an Illumina MiSeq. After implementing quality control filters, 4559 variants were identified. Of these, 92 were present in the coding regions (43 missense, 1 nonsense, and 48 synonymous), 1414 in introns, 3029 in the upstream region, and 240 in the downstream region. In silico analysis of the missense short nucleotide variants identified 12 mutations with potential to disrupt collagenous lectin protein structure or function, 280 mutations located within predicted transcription factor binding sites, and 95 mutations located within predicted microRNA binding elements. Analysis of allelic association identified 113 mutations that segregated between the infectious/autoinflammatory and non-infectious populations. The variants discovered in this experiment represent potential genetic contributors to disease susceptibility of horses, and will serve as candidates for further population-level genotyping. This study contributes to the growing body of evidence that pooled, high-throughput sequencing is a viable strategy for cost-effective variant discovery.

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