大腸菌W.のバッチ培養および連続培養におけるアセチル化に鈍感なアセチル-CoA合成酵素の発現がグルコースとアセテートの共利用に及ぼす影響の解析

Characterizing the effect of expression of an acetyl-CoA synthetase insensitive to acetylation on co-utilization of glucose and acetate in batch and continuous cultures of E. coli W.

• Katharina Novak
• Lukas Flöckner
• Anna Maria Erian
• Philipp Freitag
• Christoph Herwig
• Stefan Pflügl

抄録

背景:

大腸菌Wは、高いストレス耐性と低いアセテート分泌により、いくつかの代謝物や組換えタンパク質の生産に適した宿主であることが報告されていますが、グルコースとアセテートなどの基質を同時に利用することが課題となっています。しかし、グルコースとアセテートのような他の基質の同時共利用は依然として課題である。アセテート同化に関わる重要な酵素の一つであるアセチル-CoA合成酵素の活性は、転写レベルと翻訳後レベルで厳密に制御されている。本研究の目的は、アセチル化に鈍感なアセチル-CoA-シンテターゼを過剰発現させるために大腸菌 W を作製し、グルコース、アセテート、および両基質の共利用を用いたバッチ培養および連続培養において、この株を特徴づけることであった。

BACKGROUND: Due to its high stress tolerance and low acetate secretion, Escherichia coli W is reported to be a good production host for several metabolites and recombinant proteins. However, simultaneous co-utilization of glucose and other substrates such as acetate remains a challenge. The activity of acetyl-CoA-synthetase, one of the key enzymes involved in acetate assimilation is tightly regulated on a transcriptional and post-translational level. The aim of this study was to engineer E. coli W for overexpression of an acetylation insensitive acetyl-CoA-synthetase and to characterize this strain in batch and continuous cultures using glucose, acetate and during co-utilization of both substrates.

結果:

アセチル化感受性のないアセチル-CoA 合成酵素を過剰発現させた大腸菌 W は、グルコースと高濃度のアセテートを含むバッチプロセスにおいて、対照株と比較してアセテートの取り込みが 2.7 倍に増加することを示し、グルコースとアセテートのより効率的な共消費を示した。酢酸を炭素源として使用した場合、過剰発現株では、酢酸の毒性が緩和されたためか、バッチ持続時間が有意に減少した。グルコースを用いて希釈率を変えてケモスタット培養を行ったところ、過剰発現株と対照株の間にはわずかな差しか認められなかった。0.20～0.70h の間の希釈率を用いた加速培養では、大腸菌 W は広い範囲でグルコースとアセテートを効率的に共利用する能力を有していることが示唆された。アセチル-CoA合成酵素を発現させた場合、対照株と比較して低い希釈率でアセテートとグルコースの蓄積が見られた。これは、遺伝子発現解析から明らかになったように、過剰発現株では acs と pta-ackA の比率が高くなっていることに起因すると考えられる。これは、Pta-AckA-Acsサイクルのアンバランスにより、エネルギー散逸が亢進したことに起因すると考えられる。さらに、アセチル-CoA合成酵素と共転写された遺伝子であるyjcHとactPは、希釈率を上げると有意なダウンレギュレーションを示した。

RESULTS: Escherichia coli W engineered to overexpress an acetylation-insensitive acetyl-CoA synthetase showed a 2.7-fold increase in acetate uptake in a batch process containing glucose and high concentrations of acetate compared to a control strain, indicating more efficient co-consumption of glucose and acetate. When acetate was used as the carbon source, batch duration could significantly be decreased in the overexpression strain, possibly due to alleviation of acetate toxicity. Chemostat cultivations with different dilution rates using glucose revealed only minor differences between the overexpression and control strain. Accelerostat cultivations using dilution rates between 0.20 and 0.70 h indicated that E. coli W is naturally capable of efficiently co-utilizing glucose and acetate over a broad range of specific growth rates. Expression of acetyl-CoA synthetase resulted in acetate and glucose accumulation at lower dilution rates compared to the control strain. This observation can possibly be attributed to a higher ratio between acs and pta-ackA in the overexpression strain as revealed by gene expression analysis. This would result in enhanced energy dissipation caused by an imbalance in the Pta-AckA-Acs cycle. Furthermore, yjcH and actP, genes co-transcribed with acetyl-CoA synthetase showed significant down-regulation at elevated dilution rates.

結論:

アセチル化感受性のないアセチル-CoA 合成酵素を発現する大腸菌 W は、グルコースとアセテートを用いた混合飼料プロセスの有望な候補であることが示された。バッチ培養と連続培養を比較した結果、グルコースとアセテートの共利用挙動に明確な違いが見られたため、マルチオミクス解析などの追加研究や、より効率的な共利用株の開発が必要であることが示された。

CONCLUSIONS: Escherichia coli W expressing an acetylation-insensitive acetyl-CoA synthetase was shown to be a promising candidate for mixed feed processes using glucose and acetate. Comparison between batch and continuous cultures revealed distinct differences in glucose-acetate co-utilization behavior, requiring additional investigations such as multi-omics analysis and further engineering towards even more efficient co-utilization strains of E. coli W.