ビオチンカルボキシラーゼの触媒機構：定常状態の速度論的研究

Catalytic mechanism of biotin carboxylase: steady-state kinetic investigations.

• P A Tipton
• W W Cleland

抄録

ビオチンカルボキシラーゼを新たな方法で大腸菌から精製し、その定常状態の速度パラメータを調べた。酵素にMgATPと重炭酸塩をランダムに添加し、次いでビオチンを添加した。重炭酸塩とMgATPの両方が急速に平衡状態で添加される。V/Kプロファイルでは、6.6のpKを持つ触媒塩基が観察される。不活性化の研究はまた、触媒に不可欠な活性部位のスルフヒドリル基を明らかにした。ビオチンの互変異性化には酸塩基触媒が必要であり、これはおそらくカルボキシル基供与体に向かってビオチンの求核性を高めていると考えられる。また、Vmaxプロファイルには、役割が不明なpKが6.6の第二の酵素基が見られた。ビオチンカルボキシラーゼ触媒によるリン酸カルバモイルによるADPのリン酸化反応のpHプロファイルは、前方反応のプロファイルと同じ形をしており、これは、どちらの方向のトランスリン酸化触媒のために酵素塩基が同じプロトン化状態を仮定していることを示しています。2価の金属イオンとしてMgを使用した場合、ATPのチオヌクレオチド類似体の反応性がないことから、反応に必要な金属イオンが両方ともヌクレオチドに配位していることが示唆される。第二の金属イオンは反応に絶対的に必要であり、単に反応を活性化するだけではないようである。ビカボン酸依存性ビオチン非依存性ATPアーゼ活性の特徴付けは、カルボキシル化がカルボキシリン酸中間体を介して進行することを強く示唆している。

Biotin carboxylase was purified from Escherichia coli by a new procedure, and its steady-state kinetic parameters were examined. MgATP and bicarbonate add to the enzyme randomly, followed by addition of biotin. Both bicarbonate and MgATP add in rapid equilibrium. A catalytic base with a pK of 6.6 is observed in V/K profiles. Inactivation studies also revealed a sulfhydryl group in the active site that is essential for catalysis. It is proposed that the acid-base catalysts are necessary for the tautomerization of biotin, which presumably enhances its nucleophilicity toward the carboxyl group donor. A second enzymic group with a pK of 6.6, whose role is unknown, is seen in Vmax profiles. The pH profiles for the biotin carboxylase catalyzed phosphorylation of ADP by carbamoyl phosphate have the same shape as the profiles for the forward reaction, which demonstrates that the enzymic bases assume the same protonation states for catalysis of transphosphorylation in either direction. The lack of reactivity of thionucleotide analogues of ATP when Mg is used as the divalent metal ion suggests that both metal ions required for reaction coordinate to the nucleotide. The second metal ion appears to be absolutely required for reaction and not merely an activator of the reaction. Characterization of a bicabonate-dependent biotin-independent ATPase activity strongly suggests that carboxylation proceeds via a carboxyphosphate intermediate.