急性肺損傷の好中球性炎症モデルとしての空気充填ゼブラフィッシュ泳ぎ膀胱の操作

Manipulating the air-filled zebrafish swim bladder as a neutrophilic inflammation model for acute lung injury.

• Yuefei Zhang
• Hongcui Liu
• Junlin Yao
• Yanfeng Huang
• Shenlu Qin
• Zheng Sun
• Yingchun Xu
• Shu Wan
• Hongqiang Cheng
• Chunqi Li
• Xue Zhang
• Yuehai Ke

抄録

急性肺障害（ALI）およびそのより重篤な形態である急性呼吸窮迫症候群（ARDS）は、治療の制限のために高い死亡率に関連している生命を脅かす疾患である。好中球は、肺胞微小環境の炎症や損傷を促進することにより、ALI/ARDSの発症に重要な役割を果たしています。これまでのところ、in vivoでの機能的アプローチは、哺乳類の呼吸管の解剖学的末端に位置する肺胞嚢へのアクセス性の悪さによって制限されてきました。本研究では、ゼブラフィッシュの幼虫の泳動膀胱を、肺動脈硬化時の肺好中球浸潤を調べるためのリアルタイムin vivoモデルとして初めて特徴づけた。我々は、マイクロインジェクションによるリポ多糖類（LPS）、ポリICおよびシリカナノ粒子を含む外因性物質の送達が、水泳膀胱への有意な時間および用量依存性の好中球の募集を誘発したことを観察した。好中球は、LPSを注入した水泳膀胱に、空腸管周辺の血液毛細血管または前頭骨管付近の部位を介して浸潤した。LPS後の炎症性サイトカインmRNAレベルの上昇は、生体内での好中球凝集と一致していた。LPSを注射した膀胱の顕微鏡検査では、上皮の歪み、小胞体の腫れ、ミトコンドリアの損傷など、その場での損傷がさらに明らかになった。このモデルを用いたインヒビタースクリーニングアッセイでは、Shp2の阻害に応答して、LPSを注入した泳ぎ膀胱への好中球遊走が減少することが示された。さらに、骨髄系細胞におけるShp2の薬理学的抑制および標的的破壊は、LPS誘発ALIマウスモデルにおける肺炎を緩和した。さらに、我々はこのモデルを使用して、患者からの気管支肺胞洗浄液を泳動膀胱にマイクロ注入することにより、肺炎誘発性好中球のリクルートを評価した；この注入は、対照と比較して好中球凝集を促進した。結論として、我々の知見は、肺胞損傷のメカニズムと薬物スクリーニング研究のための有望で強力なモデルとしてのスイムブラダーを強調している。

Acute lung injury (ALI) and its more severe form, acute respiratory distress syndrome (ARDS), are life-threatening diseases that are associated with high mortality rates due to treatment limitations. Neutrophils play key roles in the pathogenesis of ALI/ARDS by promoting the inflammation and injury of the alveolar microenvironment. To date, in vivo functional approaches have been limited by the inaccessibility to the alveolar sacs, which are located at the anatomical terminal of the respiratory duct in mammals. We are the first to characterize the swim bladder of the zebrafish larva, which is similar to the mammalian lung, as a real-time in vivo model for examining pulmonary neutrophil infiltration during ALI. We observed that the delivery of exogenous materials, including lipopolysaccharide (LPS), Poly IC and silica nanoparticles, by microinjection triggered significant time- and dose-dependent neutrophil recruitment into the swim bladder. Neutrophils infiltrated the LPS-injected swim bladder through the blood capillaries around the pneumatic duct or a site near the pronephric duct. An increase in the post-LPS inflammatory cytokine mRNA levels coincided with the in vivo neutrophil aggregation in the swim bladder. Microscopic examinations of the LPS-injected swim bladders further revealed in situ injuries, including epithelial distortion, endoplasmic reticulum swelling and mitochondrial injuries. Inhibitor screening assays with this model showed a reduction in neutrophil migration into the LPS-injected swim bladder in response to Shp2 inhibition. Moreover, the pharmacological suppression and targeted disruption of Shp2 in myeloid cells alleviated pulmonary inflammation in the LPS-induced ALI mouse model. Additionally, we used this model to assess pneumonia-induced neutrophil recruitment by microinjecting bronchoalveolar lavage fluid from patients into swim bladders; this injection enhanced neutrophil aggregation relative to the control. In conclusion, our findings highlight the swim bladder as a promising and powerful model for mechanistic and drug screening studies of alveolar injuries.