活性部位飽和突然変異誘発法による二機能性非ヘム鉄オキシゲナーゼ・カルバペネム合成酵素の機構解明

Mechanistic insights into the bifunctional non-heme iron oxygenase carbapenem synthase by active site saturation mutagenesis.

• Ryan M Phelan
• Craig A Townsend

抄録

β-ラクタム系抗生物質のカルバペネム類は、その顕著な効力、抗菌スペクトル、およびβ-ラクタマーゼによる不活化に対する耐性で知られている。チエナマイシンのような構造的に"複雑"なカルバペネムの生合成は、カルバペネム-3-カルボキシレート（"単純"カルバペネム）と初期の生化学的ステップを共有しているが、C5での必要な反転と特徴的なα,β-不飽和カルボキシレートの形成は、2つのグループの間で起源が異なっている。ここでは、単純なカルバペネムの生産において、末端反応であるC5エピマー化と脱飽和を担う、機構的に異なる二官能性の非ヘム鉄α-ケトグルタレート依存性酵素であるカルバペネム合成酵素について考察する。興味深いことに、この酵素は2つの立体異性基質を受け入れ、それぞれを共通の活性抗生物質に変換します。酵素と生成物の不安定性の両方のために、活性部位と選択された第二球残基の飽和変異誘発に頼ると、構造変更に対するCarCの耐性のプロファイルが明らかに異なっていた。結晶構造と突然変異データに基づいて、インシリコドッキングを用いて、活性部位における各災害異性化基質の位置を提案した。反応性のある鉄-オキソ中心に対する2つの配向は、C5-エピマー化とC2/3-脱飽和という2つの異なる反応で明らかになった。これらの観察結果から、活性部位のチロシンTyr67がラジカルキャリアとして機能すると仮定した場合、二環式環の反転を達成するために水素を供与した後、活性部位のチロシンTyr67がラジカルキャリアとして機能するという単一の触媒サイクルとは対照的に、2つの完全な酸化サイクルを含む2段階の反応スキームを支持している。

The carbapenem class of β-lactam antibiotics is known for its remarkable potency, antibacterial spectrum, and resistance to β-lactamase-mediated inactivation. While the biosynthesis of structurally "complex" carbapenems, such as thienamycin, share initial biochemical steps with carbapenem-3-carboxylate ("simple" carbapenem), the requisite inversion at C5 and formation of the characteristic α,β-unsaturated carboxylate are different in origin between the two groups. Here, we consider carbapenem synthase, a mechanistically distinct bifunctional non-heme iron α-ketoglutarate-dependent enzyme responsible for the terminal reactions, C5 epimerization and desaturation, in simple carbapenem production. Interestingly, this enzyme accepts two stereoisomeric substrates and transforms each to a common active antibiotic. Owing both to enzyme and product instability, resorting to saturation mutagenesis of active site and selected second-sphere residues gave clearly differing profiles of CarC tolerance to structural modification. Guided by a crystal structure and the mutational data, in silico docking was used to suggest the positioning of each disastereomeric substrate in the active site. The two orientations relative to the reactive iron-oxo center are manifest in the two distinct reactions, C5-epimerization and C2/3-desaturation. These observations favor a two-step reaction scheme involving two complete oxidative cycles as opposed to a single catalytic cycle in which an active site tyrosine, Tyr67, after hydrogen donation to achieve bicyclic ring inversion, is further hypothesized to serve as a radical carrier.