タウロリトコレート誘発MRP2の回収にはプロテインキナーゼCϵによるMARCKSのリン酸化が関与していることを明らかにした

Taurolithocholate-induced MRP2 retrieval involves MARCKS phosphorylation by protein kinase Cϵ in HUH-NTCP Cells.

• Christopher M Schonhoff
• Cynthia R L Webster
• M Sawkat Anwer

抄録

アンラベル:

タウロリットホコレート（TLC）は、管状膜からのMrp2回収を誘導することにより、多剤耐性関連タンパク質2（Mrp2）基質の胆道排泄を急性的に抑制し、環状アデノシン一リン酸（cAMP）は漿膜（PM）-MRP2を増加させることが知られています。TLCの効果は、プロテインキナーゼCϵ(PKCϵ)を介して媒介されている可能性がある。ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質（MARCKS）は、膜結合型F-アクチン架橋タンパク質であり、PKCによってリン酸化されている。MARCKSのリン酸化はエンドサイトーシスに関与しており、その根底にあるメカニズムは、リン酸化ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質(pMARCKS)が膜から剥離することであると考えられている。本研究の目的は、TLCによるMRP2回収がPKCϵを介したMARCKSのリン酸化に関与しているという仮説を検証することであった。研究は、タウロコロール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを安定的にトランスフェクションしたHuH7細胞（HuH-NTCP細胞）とラット肝細胞を用いて行った。その結果、TLCはHuH-NTCP細胞及び肝細胞においてPM-PKCϵを増加させ、PM-MRP2を減少させたが、cAMPはPM-PKCϵに影響を与えず、PM-MRP2を増加させた。HuH-NTCP細胞では、ドミナントネガティブ（DN）PKCϵがTLCによるPM-MRP2の減少を逆転させたが、cAMPによるPM-MRP2の増加には影響を与えなかった。TLCはcAMPではなく、HuH-NTCP細胞と肝細胞においてMARCKSのリン酸化を増加させた。TLCと酢酸ミリスチン酸フォルボルはHuH-NTCP細胞において細胞質のpMARCKSを増加させ、PM-MARCKSを減少させた。TLCはDN-PKCϵをトランスフェクションしたHuH-NTCP細胞ではMARCKSのリン酸化を増加させることができず、PKCϵがMARCKSのリン酸化を促進することが示唆された。リン酸化欠損MARCKSをトランスフェクションしたHuH-NTCP細胞では、TLCはMARCKSのリン酸化を増加させず、PM-MRP2を減少させることができなかった。

UNLABELLED: Taurolithocholate (TLC) acutely inhibits the biliary excretion of multidrug-resistant associated protein 2 (Mrp2) substrates by inducing Mrp2 retrieval from the canalicular membrane, whereas cyclic adenosine monophosphate (cAMP) increases plasma membrane (PM)-MRP2. The effect of TLC may be mediated via protein kinase Cϵ (PKCϵ). Myristoylated alanine-rich C kinase substrate (MARCKS) is a membrane-bound F-actin crosslinking protein and is phosphorylated by PKCs. MARCKS phosphorylation has been implicated in endocytosis, and the underlying mechanism appears to be the detachment of phosphorylated myristoylated alanine-rich C kinase substrate (pMARCKS) from the membrane. The aim of the present study was to test the hypothesis that TLC-induced MRP2 retrieval involves PKCϵ-mediated MARCKS phosphorylation. Studies were conducted in HuH7 cells stably transfected with sodium taurocholate cotransporting polypeptide (HuH-NTCP cells) and in rat hepatocytes. TLC increased PM-PKCϵ and decreased PM-MRP2 in both HuH-NTCP cells and hepatocytes. cAMP did not affect PM-PKCϵ and increased PM-MRP2 in these cells. In HuH-NTCP cells, dominant-negative (DN) PKCϵ reversed TLC-induced decreases in PM-MRP2 without affecting cAMP-induced increases in PM-MRP2. TLC, but not cAMP, increased MARCKS phosphorylation in HuH-NTCP cells and hepatocytes. TLC and phorbol myristate acetate increased cytosolic pMARCKS and decreased PM-MARCKS in HuH-NTCP cells. TLC failed to increase MARCKS phosphorylation in HuH-NTCP cells transfected with DN-PKCϵ, and this suggested PKCϵ-mediated phosphorylation of MARCKS by TLC. In HuH-NTCP cells transfected with phosphorylation-deficient MARCKS, TLC failed to increase MARCKS phosphorylation or decrease PM-MRP2.

結論:

これらの結果から、TLCによるMRP2の回収は、TLCを介したPKCϵの活性化とMARCKSのリン酸化、そしてその結果としてのMARCKSの膜からの剥離が関与しているという仮説を支持するものである。

CONCLUSION: Taken together, these results support the hypothesis that TLC-induced MRP2 retrieval involves TLC-mediated activation of PKCϵ followed by MARCKS phosphorylation and consequent detachment of MARCKS from the membrane.

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