低濃度コラゲナーゼを用いた示差消化法を用いたマウスライディッヒ細胞の単離に関する研究

Research on the isolation of mouse Leydig cells using differential digestion with a low concentration of collagenase.

• Jie Sun
• Liang Zhong
• Yingjian Zhu
• Guohua Liu

抄録

本研究の目的は、マウス精巣からライディッヒ細胞を単離・精製する新規な方法を確立することであった。排卵後マウスの精巣を採取し、低濃度コラゲナーゼNB4で15分2回消化した。得られた細胞を１０％ＦＢＳを添加した低グルコースＤＭＥＭで培養した。免疫蛍光を用いて、３β-ヒドロキシステロイド脱水素酵素、コレステロール側鎖切断酵素（ＣＹＰ１１Ａ１）、１７α-ヒドロキシラーゼ／１７，２０-リアーゼ（ＣＹＰ１７Ａ１）を含むライディッヒ細胞バイオマーカーの発現を検出した。その結果、単離されたライディッヒ細胞の純度は69.6±4.16%であることが判明した。初代培養7日後には90%まで上昇した。初代培養時にテストステロン合成酵素のスペクトルを検出することができた。結論として、低濃度のコラゲナーゼを差動消化に適用することにより、大量の生存可能なライディッヒ細胞の単離が可能となった。

The aim of this study was to establish a novel method for isolating and purifying Leydig cells from mice testes. Testes of postpuberal mice were harvested and digested in a low concentration of collagenase NB4 for 15 min 2 times. Cells obtained were cultured in low glucose DMEM with 10% FBS. Immunofluorescence was used to detect the expression of Leydig cell biomarkers including 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, cholesterol side-chain cleaving enzyme (CYP11A1) and 17α-hydroxylase/17,20-lyase (CYP17A1). It was found that the purity of the isolated Leydig cells was 69.6 ± 4.16%. After 7 days in primary culture, it increased to 90%. The testosterone synthase spectrum could be detected at the primary culture. In conclusion, the application of a low concentration of collagenase for differential digestion allows isolation of large quantities of viable Leydig cells.