高酸素マウス網膜の形態学的、機能的、遺伝子発現解析

Morphological, functional and gene expression analysis of the hyperoxic mouse retina.

• Riccardo Natoli
• Krisztina Valter
• Vicki Chrysostomou
• Jonathan Stone
• Jan Provis

抄録

本研究では、遺伝子発現の変化を解釈するための基礎として、C57BL/6Jマウスの網膜の形態と機能に及ぼす高酸素への長期暴露（最大35日）の影響を調べた。C57BL/6J系統のマウスを出生時から薄暗い環状照明（12h 5lux, 12h dark）で飼育した。成体動物（90-110日）は、最大35dまでの間、連続的な過酸素（75％酸素）に曝露した。網膜は0d後（対照）、3d後、7d後、14d後、35d後に調べた。TUNEL法を用いて、光受容体死の空間的・時間的パターンをマッピングした。免疫組織化学と特異的アッセイを用いて、ストレス関連タンパク質（GFAP）の発現と主要な抗酸化酵素（SOD）の活性を評価した。暗順応フラッシュ網膜電図は、ロッドおよびコーンの機能を評価するために使用した。Affymetrix GenechipsにハイブリダイズしたRNAを、曝露の最初の3dの間の遺伝子発現を評価するために使用した。光受容体は、最初の7dの高酸素曝露の間は安定していたが、その後、視床下0.5mmの「ホットスポット」から始まり、周囲の網膜に広がっていく進行性の損傷と変性を示した。SOD活性は14dで上昇したが、それ以前の時点では上昇しなかった。GFAPの発現は3dからミュラー細胞でアップレギュレートされた。ERGのロッドとコーン成分は3dと7dで超正常であったが、その後コントロールレベル以下に低下した。遺伝子発現の変化により、この初期の機能の超正常化のメカニズムが示唆された。14d 曝露では、光受容体の損傷と死が顕著に広がっており、それに対応して機能が低下した。しかし、3d曝露では、ロッドの構造は明らかに損傷を受けていないにもかかわらず、高酸素が超正常な機能反応を誘発した。早期（3日間）の遺伝子発現の変化は、この現象に関与するメカニズムについての部分的な洞察を提供している。

This study examined the impact of prolonged (up to 35 day) exposure to hyperoxia on the morphology and function of the retina, in the C57BL/6J mouse, as a basis for interpretation of gene expression changes. Mice of the C57BL/6J strain were raised from birth in dim cyclic illumination (12 h 5 lux, 12 h dark). Adult animals (90-110 days) were exposed to continuous hyperoxia (75% oxygen) for up to 35 d. Retinas were examined after 0 d (controls), 3 d, 7 d, 14 d and 35 d. Spatial and temporal patterns of photoreceptor death were mapped, using the TUNEL technique. Immunohistochemistry and a specific assay were used to assess the expression of a stress-related protein (GFAP) and the activity of key antioxidant enzymes (SOD). The dark-adapted flash electroretinogram was used to assess the function of rods and cones. RNA hybridized to Affymetrix Genechips was used to assess gene expression during the first 3 d of exposure. Photoreceptors were stable during the first 7 d exposure to hyperoxia, but thereafter showed progressive damage and degeneration, which began in a 'hot-spot' 0.5 mm inferior to the optic disc, then spread into surrounding retina. SOD activity was upregulated at 14 d, but not at earlier time points. GFAP expression was upregulated in Müller cells from 3 d. Rod and cone components of the ERG were supernormal at 3 d and 7 d, but then fell below control levels. Gene expression changes suggested possible mechanisms for this early supernormality of function. At 14 d exposure, damage to and death of photoreceptors were prominent and spreading, and function was correspondingly degraded. However at 3 d exposure, hyperoxia-induced supernormal functional responses in rods, while leaving their structure apparently undamaged. Variations in early (3 days) gene expression provide a partial insight into the mechanisms involved in this.

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