Flk2/Flt3を発現するCD34+CD38-単細胞から増殖させたクローン細胞による非肥満糖尿病/重症複合免疫不全マウスにおけるヒト造血の再構築

Reconstitution of human haematopoiesis in non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice by clonal cells expanded from single CD34+CD38- cells expressing Flk2/Flt3.

• Yasuhiro Ebihara
• Mika Wada
• Takahiro Ueda
• Ming-Jiang Xu
• Atsushi Manabe
• Ryuhei Tanaka
• Mamoru Ito
• Hideo Mugishima
• Shigetaka Asano
• Tatsutoshi Nakahata
• Kohichiro Tsuji

抄録

本研究では、チロシンキナーゼ受容体であるFlk2/Flt3のヒト臍帯血CD34+造血前駆体/幹細胞での発現を調べた。フローサイトメトリー解析の結果、CD34+細胞の80%とその未熟な小集団であるCD34+CD33-細胞とCD34+CD38-細胞にFlk2/Flt3が発現していた。選別されたCD34+Flk2/Flt3+細胞およびCD34+Flk2/Flt3-細胞のメチセルロースクローナル培養は、骨髄細胞前駆細胞の大部分がFlk2/Flt3を発現していることを示したが、赤血球および造血多能性前駆細胞は両方の分画で共有されていた。1×10(4)系統マーカー陰性(Lin-)CD34+Flk2/Flt3-細胞を非肥満糖尿病/重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウスに移植したところ、移植後11-12週目に骨髄中にヒトCD45+細胞を保有していたレシピエントはいなかった。対照的に、1×10(4) Lin-CD34+Flk2/Flt3+細胞を移植したすべてのレシピエントは、移植に成功した。さらに、Flk2/Flt3リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、インターロイキン6/可溶性インターロイキン6受容体の複合体を用いて培養した単一のLin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+細胞から増殖させたクローン細胞を個別にNOD/SCIDマウスに移植した。移植後20～21週目には、培養7日目に採取した10クローン中3クローン、培養14日目に採取した6クローン中3クローンが、レシピエント骨髄でヒト造血を再構成することができた。これらの結果から、Flk2/Flt3は、長期再分化型の造血幹細胞を含む多種多様なヒト造血細胞に発現していることが示された。

In the present study, we examined the expression of Flk2/Flt3, a tyrosine kinase receptor, on human cord blood CD34+ haematopoietic progenitor/stem cells. In flow cytometric analysis, Flk2/Flt3 was expressed on 80% of CD34+ cells and their immature subpopulations, CD34+CD33- and CD34+CD38- cells. Methycellulose clonal culture of sorted CD34+Flk2/Flt3+ and CD34+Flk2/Flt3- cells showed that most of myelocytic progenitors expressed Flk2/Flt3, but erythroid and haematopoietic multipotential progenitors were shared by both fractions. When 1 x 10(4) lineage marker-negative (Lin-)CD34+Flk2/Flt3- cells were transplanted into non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice, none of the recipients possessed human CD45+ cells in bone marrow 11-12 weeks after the transplantation. In contrast, all recipients transplanted with 1 x 10(4) Lin-CD34+Flk2/Flt3+ cells showed successful engraftment. Furthermore, clonal cells expanded from single Lin-CD34+CD38-Flk2/Flt3+ cells in the culture with Flk2/Flt3 ligand, stem cell factor, thrombopoietin, and a complex of interleukin 6/soluble interleukin 6 receptor were individually transplanted into NOD/SCID mice. At 20 to 21 weeks after the transplantation, three out of 10 clones harvested at d 7 of culture, and three out of six clones at d 14 could reconstitute human haematopoiesis in recipient marrow. These results demonstrated that Flk2/Flt3 was expressed on a wide variety of human haematopoietic cells including long-term-repopulating haematopoietic stem cells.