RNAポリメラーゼIIの組み立てにおける複数のサブユニット-サブユニット接触の関与

Involvement of multiple subunit-subunit contacts in the assembly of RNA polymerase II.

• M Kimura
• A Ishihama

抄録

分裂酵母Schizo-saccharomyces pombe由来のRNAポリメラーゼIIは、Rpb1-Rpb12の12種のサブユニットから構成されている。Rpb4を除くこれらのサブユニットをバキュロウイルス発現ベクターで培養した昆虫細胞で同時に発現させた。ウイルス感染細胞内で形成されたサブユニット複合体の単離のために、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）配列をｒｐｂ３のｃＤＮＡに融合させてＧＳＴ-ｒｐｂ３融合タンパク質を生成し、デカヒスチジンタグ配列をｒｐｂ１のｃＤＮＡに挿入してＲｐｂ１Ｈタンパク質を生成した。グルタチオンおよびNi(2+)カラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより、Rpb1H、Rpb2、GST-Rpb3、Rpb5、Rpb7、Rpb8およびRpb11の7つのサブユニットからなる複合体を同定した。GST-Rpb3の発現を省略すると、Rpb11の複合体への組み立てが減少した。Rpb3と他の6つのサブユニットとの間の直接的な相互作用は、ペアワイズ共発現実験によって検出された。その結果、Rpb11はRpb3とRpb8の相互作用を促進し、Rpb8はRpb1とRpb3の相互作用をある程度促進することが明らかになった。本研究では、RNAポリメラーゼIIの集合体が複数のサブユニット-サブユニットの接触によって安定化されるメカニズムを提案した。

RNA polymerase II from the fission yeast Schizo-saccharomyces pombe consists of 12 species of subunits, Rpb1-Rpb12. We expressed these subunits, except Rpb4, simultaneously in cultured insect cells with baculovirus expression vectors. For the isolation of subunit complexes formed in the virus-infected cells, a glutathione S -transferase (GST) sequence was fused to the rpb3 cDNA to produce GST-Rpb3 fusion protein and a decahistidine-tag sequence was inserted into the rpb1 cDNA to produce Rpb1H protein. After successive affinity chromatography on glutathione and Ni(2+)columns, complexes consisting of the seven subunits, Rpb1H, Rpb2, GST-Rpb3, Rpb5, Rpb7, Rpb8 and Rpb11, were identified. Omission of the GST-Rpb3 expression resulted in reduced assembly of the Rpb11 into the complex. Direct interaction between Rpb3 and the other six subunits was detected by pairwise coexpression experiments. Coexpression of various combinations of a few subunits revealed that Rpb11 enhances Rpb3-Rpb8 interaction and consequently Rpb8 enhances Rpb1-Rpb3 interaction to some extent. We propose a mechanism in which the assembly of RNA poly-merase II is stabilized through multiple subunit-subunit contacts.