16S rRNA遺伝子断片のPCR制限断片長多型解析による臨床検体中のBartonella種の直接同定

Identification of Bartonella species directly in clinical specimens by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of a 16S rRNA gene fragment.

• G M Matar
• J E Koehler
• G Malcolm
• M A Lambert-Fair
• J Tappero
• S B Hunter
• B Swaminathan

抄録

現在、Bartonella henselaeとB. quintanaの2種のBartonellaが、ヒト免疫不全ウイルス感染症患者に桿状血管腫症を引き起こすことが確立されている。また、B. henselaeは猫ひっかき病を引き起こし、B. quintana、B. henselae、B. elizabethaeは免疫不全者に菌血症や心内膜炎を引き起こす可能性がある。我々は，臨床検体中のBartonella菌を直接検出し，菌種レベルで同定するためのPCR制限断片長多型に基づくアッセイ法を開発した．これは，16SリボソームDNAを運ぶ遺伝子の保存領域に由来するプライマーを用いてBartonella DNAをPCR増幅した後，DdeIおよびMseI制限エンドヌクレアーゼを用いて制限分析を行うことによって達成された．25人から得られた25の臨床サンプルから，Bartonella属特異的な296-bp断片を増幅した．アンプリコンの制限解析の結果，B. henselaeとB. quintanaのアンプリコンをDdeIで消化した場合には同一のパターンが見られたが，B. vinsoniiとB. elizabethaeのアンプリコンを同じ酵素で消化した場合には異なるユニークなパターンが見られた．MseI消化では、B. henselaeとB. vinsoniiはほぼ同じパターンを示したが、B. quintanaとB. elizabethaeは異なるパターンを示した。MseIとDdeIで生成された制限解析データを組み合わせることで、各種に特徴的な「シグネチャー」制限パターンが得られた。これらのパターンは、各組織標本に関連するBartonella種の同定に有用であった。

It is now established that two species of Bartonella, namely, Bartonella henselae and B. quintana, cause bacillary angiomatosis in human immunodeficiency virus-infected patients. In addition, B. henselae causes cat scratch disease and B. quintana, B. henselae, and B. elizabethae can cause bacteremia and endocarditis in immunocompetent persons. We have developed a PCR-restriction fragment length polymorphism-based assay for direct detection and identification to species level of Bartonella in clinical specimens. This is accomplished by PCR amplification of Bartonella DNA using primers derived from conserved regions of the gene carrying the 16S ribosomal DNA, followed by restriction analysis using DdeI and MseI restriction endonucleases. We amplified a Bartonella genus-specific 296-bp fragment from 25 clinical samples obtained from 25 different individuals. Restriction analysis of amplicons showed that identical patterns were seen from digestion of B. henselae and B. quintana amplicons with DdeI, whereas a different unique pattern was seen by using the same enzyme with B. vinsonii and B. elizabethae. With MseI digestion, B. henselae and B. vinsonii gave nearly identical patterns while B. quintana and B. elizabethae gave a different pattern. By combining the restriction analysis data generated with MseI and DdeI, unique "signature" restriction patterns characteristic for each species were obtained. These patterns were useful in identifying the Bartonella species associated with each tissue specimen.