RNA構造解析のための光親和性プローブの配置に、環状変換と末端修飾を使用します

Use of circular permutation and end modification to position photoaffinity probes for analysis of RNA structure.

• M E Harris
• E L Christian

抄録

光架橋は、比較的少量の生物学的材料で一次構造解析を可能にし、複雑なインビトロシステムに適用することができます。この論文では、円形にパーミュレートされたRNAの末端修飾によって目的のRNA内にアリルアジドとチオヌクレオチド光媒質の両方を配置するための方法を説明します。この技術の適用は、生化学的および系統比較データと一緒に、細菌のリボヌクレアーゼPリボザイム-基質複合体の構造モデルを開発するために使用された制約のライブラリを提供しました。インビトロ転写のための円形にパーミュレートされた遺伝子は、タンデム遺伝子からPCRによって生成される。環状にパーミュレートされたＲＮＡ転写物は、アリルアジド架橋試薬を用いて５'末端および３'末端の両方で高効率に修飾することができ、または６-チオグアノシンのような光活性ヌクレオチドアナログ一リン酸塩を用いて転写をプライミングすることができる。これらの架橋剤は、広範囲の実験条件で使用することができるが、紫外線によって活性化されるまでは不活性のままである。架橋部位は、その後、ゲル精製された架橋種の逆転写酵素プライマー延長によってマッピングされる。これらの方法のための基本的なプロトコルを提供することに加えて、我々は、ネイティブRNAの構造に対する架橋データの関連性を確立するためのアプローチについて議論する。

Photocrosslinking allows first-order structural analysis with relatively small amounts of biological material and can be applied in complex in vitro systems. In this article we describe methods for positioning both arylazide and thionucleotide photoagents within an RNA of interest by end modification of circularly permuted RNAs. Application of this technique provided a library of constraints that, together with biochemical and phylogenetic comparative data, were used to develop a structure model of the bacterial ribonuclease P ribozyme-substrate complex. Circularly permuted genes for in vitro transcription are generated by PCR from tandem genes. Circularly permuted RNA transcripts can be modified with high efficiency at both the 5' and 3' termini with arylazide crosslinking reagents, or transcription can be primed with photoactive nucleotide analog monophosphates such as 6-thioguanosine. These crosslinking agents can be used over a wide range of experimental conditions but remain inert until they are activated by UV light. Crosslinked sites are subsequently mapped by reverse transcriptase primer extension of gel-purified crosslinked species. In addition to providing basic protocols for these methods, we discuss approaches for establishing the relevance of crosslinking data to native RNA structure.

Copyright 1999 Academic Press.