酵素分解減法(EDS)による差動cDNAクローニング

Differential cDNA cloning by enzymatic degrading subtraction (EDS).

• J Zeng
• R A Gorski
• D Hamer

抄録

PCR増幅されたcDNAからサブトラクティブライブラリーを構築するための酵素分解サブトラクション(EDS)と呼ばれる新しい方法について述べる。この方法の新規な特徴は、i) テスターDNAはチオヌクレオチドの取り込みによってブロックされ、ii) フェノールエマルジョンの再結合によってハイブリダイゼーションの速度が加速され、iii) ドライバーcDNAとハイブリッド分子は、物理的な分割ではなく、エキソヌクレアーゼIIIとVIIによる消化によって酵素的に除去されることである。成体ラット脳では発現しているが胚性ラット脳では発現していないcDNAに富むサブトラクティブライブラリーを構築することで、EDSの有用性を実証した。

We describe a new method, called enzymatic degrading subtraction (EDS), for the construction of subtractive libraries from PCR amplified cDNA. The novel features of this method are that i) the tester DNA is blocked by thionucleotide incorporation; ii) the rate of hybridization is accelerated by phenol-emulsion reassociation; and iii) the driver cDNA and hybrid molecules are enzymatically removed by digestion with exonucleases III and VII rather than by physical partitioning. We demonstrate the utility of EDS by constructing a subtractive library enriched for cDNAs expressed in adult but not in embryonic rat brains.