DNAポリメラーゼI反応経路の律速段階

Rate-limiting steps in the DNA polymerase I reaction pathway.

• V Mizrahi
• R N Henrie
• J F Marlier
• K A Johnson
• S J Benkovic

抄録

DNAポリメラーゼIのラージフラグメントによるテンプレート指示合成中のポリ(dA)Xオリゴ(dT)へのdTTPとチミジン5'-O-(3-チオ三リン酸) (dTTP alpha S)の初期取り込み率をラピッドクエンチ法を用いて測定した。この速度は最初は等しく、非律速化学的段階であることを示していた。しかし、プライマー鎖中の連続したdTMPαS残基の数が増加するにつれて、チオヌクレオチドの取り込み率は着実に減少し、初期値の10％にまで低下した。この異常な挙動は、ホスホロチオエートを含む二重鎖に内在するらせん不安定性に起因すると考えられる。また、標識基質[α-18O2]dATPを用いた位置的同位体交換実験では、無機ピロリン酸（PPi）の存在下でも非存在下でも、大腸菌DNAポリメラーゼI（Pol I）のテンプレート反応において、α、β架橋-β-非架橋の同位体交換は無視できる程度であることが明らかになり、化学反応後のPPiの迅速な放出が示唆された。これらの観察は、化学的ステップの直前にE X DNA X dNTP複合体の構造変化に暫定的に割り当てられている速度制限ステップと一致している。さらに、基質アナログ(Sp)-dATPαSを用いて、Pol Iによって触媒されるPPi交換反応のメカニズムを調べた。α-Pでのコンフォメーションの正味の保持は、2つの連続した反転反応、すなわち、3'-水酸基の攻撃と、新たに形成されたプライマー末端へのPPiの攻撃の観点から解釈される。速度論的解析により、α-ホスホロチオエート置換は重合の初期速度に影響を与えないが、それは15〜18倍のファクターでPPi交換反応を減衰させることが明らかになった。 (ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)

The initial rates of incorporation of dTTP and thymidine 5'-O-(3-thiotriphosphate) (dTTP alpha S) into poly(dA) X oligo(dT) during template-directed synthesis by the large fragment of DNA polymerase I have been measured by using a rapid-quench technique. The rates were initially equal, indicating a nonrate-limiting chemical step. However, the rate of thionucleotide incorporation steadily diminished to 10% of its initial value as the number of consecutive dTMP alpha S residues in the primer strand increased. This anomalous behavior can be attributed to the helix instability inherent in phosphorothioate-containing duplexes. Positional isotope exchange experiments employing the labeled substrate [alpha-18O2]dATP have revealed negligible alpha, beta-bridging----beta-nonbridging isotope exchange in template-directed reactions of Escherichia coli DNA polymerase I (Pol I) both in the presence and in the absence of added inorganic pyrophosphate (PPi), suggesting rapid PPi release following the chemical step. These observations are consistent with a rate-limiting step that is tentatively assigned to a conformational change of the E X DNA X dNTP complex immediately preceding the chemical step. In addition, the substrate analogue (Sp)-dATP alpha S has been employed to examine the mechanism of the PPi exchange reaction catalyzed by Pol I. The net retention of configuration at the alpha-P is interpreted in terms of two consecutive inversion reactions, namely, 3'-hydroxyl attack, followed by PPi attack on the newly formed primer terminus. Kinetic analysis has revealed that while alpha-phosphorothioate substitution has no effect upon the initial rate of polymerization, it does attenuate the PPi exchange reaction by a factor of 15-18 fold.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)