マイクロ流体チップを用いたフッ化ジアンミン銀の細胞毒性評価と歯肉等価物

Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents.

抄録

目的:

本研究は、歯髄幹細胞（DPSC）および歯肉等価細胞に対するフッ化ジアミン銀（SDF）の細胞毒性を明らかにすることを目的とする。

OBJECTIVE: This study aims to characterize the cytotoxicity potential of silver diamine fluoride (SDF) on dental pulp stem cells (DPSC) and gingival equivalents.

方法:

96ウェルプレートで培養したDPSCを直接SDF（0.0001-0.01%）に暴露し、細胞生存率（IC）を定量化した。フロー（象牙質バリア）条件下でのDPSC生存率に対するSDFの影響は、カスタムデザインのマイクロ流体「トゥース・オン・ア・チップ」を用いて評価された。象牙質ディスク（0.5-1.5mm厚）の透過性は、ルシファーイエロー透過アッセイを用いて評価した。象牙質ディスクを38％SDFで処理（最大3時間）し、歯髄チャンネルの入口（非暴露）および出口（暴露）領域で培養したDPSCの細胞生存率（live/dead assay）を評価した。粘膜腐食能を評価するため、歯肉相当部を38%SDFで3分間または60分間処理し（OECDテストガイドライン431）、MTTアッセイと組織形態分析により特徴づけを行った。

METHODS: DPSC cultured on 96-well plates was exposed directly to SDF (0.0001-0.01%) and cell viability (IC) quantified. Effect of SDF on DPSC viability under flow (with dentin barrier) conditions was evaluated using a custom-designed microfluidic "tooth-on-a-chip". Permeability of dentin discs (0.5-1.5 mm thickness) was evaluated using lucifer yellow permeation assay. Dentin discs were treated with 38% SDF (up to 3 h), and cell viability (live/dead assay) of the DPSC cultured in the inlet (unexposed) and outlet (exposed) regions of the pulp channel was evaluated. To assess the mucosal corrosion potential, gingival equivalents were treated with 38% SDF for 3 or 60 min (OECD test guideline 431) and characterized by MTT assay and histomorphometric analysis.

結果:

SDFに直接暴露されたDPSCは、用量依存的に細胞生存率の低下を示した（IC：0.001％）。PBSとSDFに曝露したデンチンディスクの入口チャネル（内部コントロール）は、85%以上のDPSC生存率を示した。一方、SDFに曝露した象牙質ディスクの出口チャネルは、<31%と0%（それぞれ厚さ1.5mmと≤1.0mmの象牙質ディスク）の生存率の減少を示した（p<0.01）。SDFで3分間および60分間処理した歯肉等価物は、上皮の完全性の低下、細胞間凝集力の喪失、角膜層の剥離を示し、無傷の上皮の厚さが著しく減少した（p＜0.05）。

RESULTS: DPSC exposed directly to SDF showed a dose-dependent reduction in cell viability (IC: 0.001%). Inlet channels (internal control) of the tooth-on-a-chip exposed to PBS and SDF-exposed dentin discs showed > 85% DPSC viability. In contrast, the outlet channels of SDF-exposed dentin discs showed a decreased viability of < 31% and 0% (1.5 and ≤1.0 mm thick dentin disc, respectively) (p < 0.01). The gingiva equivalents treated with SDF for 3 and 60 min demonstrated decreased epithelial integrity, loss of intercellular cohesion and corneal layer detachment with significant reduction in intact epithelial thickness (p < 0.05).

意義:

SDFは象牙質（厚さ1mm以下）に浸透し、歯髄細胞の著しい死滅を誘発した。SDFはまた、歯肉上皮の完全性を破壊し、粘膜の腐食を引き起こした。

SIGNIFICANCE: SDF penetrated the dentin (≤1 mm thick) inducing significant death of the pulp cells. SDF also disrupted gingival epithelial integrity resulting in mucosal corrosion.