イタリアでヘーゼルナッツに感染した「Candidatus Phytoplasma fragariae」の初報告

First report of 'Candidatus Phytoplasma fragariae' infecting hazelnut in Italy.

抄録

イタリアは、トルコに次いで世界第2位のヘーゼルナッツの生産国です。ヴィテルボ県（ラティウム地方）は、4つの主要生産地区のうちの1つで、イタリア全体の生産量の約30％を占めています。ヘーゼルナッツの木（Corylus avellana）に深刻な影響を与える病原菌がいくつかあり、主に真菌と細菌が全栽培地域で一般的に蔓延しています。しかし、ファイトプラズマのような他の病原体が、世界中でこの作物に感染することが知られています。このうち、「Candidatus Phytoplasma fragariae」（16SrXII-E）は、最近、この植物種で初めて確認された英国（Hodgetts et al., 2015）や、スロベニア（Mehle et al., 2018; Mehle et al., 2019）でヘーゼルナッツ木の衰退と枯死に関連している。2020年7月、ヴィテルボ県にある2つの果樹園で調査が行われ、ファイトプラズマによって誘発される症状に似た、葉の黄変や巻きつき、樹勢の低下からなる症状（補足図1）が生産者により記録された。ファイトプラズマの感染の可能性を確認するため、症状のある5つの植物から葉のサンプルを採取した：果樹園1からの1株、cv.Tonda Gentile Romanaの1株と、果樹園2の4株、cv.Tonda di Giffoniからである。非症状の植物4本（各果樹園につき2本）からも試料を採取し、検出アッセイにおける陰性対照として使用した。Marzachìら(1999)に従って、CTABバッファーでホモジナイズした0.6gの葉の肋骨からDNAが抽出された。DNA抽出物は、EPPO基準PM7/133(1)-付録2（EPPO、2018）に従って、ユニバーサルプライマー対P1/P7およびR16F2n/R2を採用した直接およびネステッドPCRによって増幅された。症状のある5つのサンプルからは期待されるサイズ（1,250 bp）のネストしたアンプリコンが得られたが、症状のないサンプルにはバンドが観察されなかった。R16F2n/R2断片は、ファイトプラズマ同定のためにサンガー配列決定とRFLP解析の両方に供された。得られた配列のヌクレオチドBLAST解析（NCBI）では、99.65%から99.91%の範囲で'Ca. Phytoplasma fragariae'の多数の系統と同一性を示した。Phytoplasma fragariae'(16SrXII-E)の多数の株と99.65%から99.91%の同一性を示した。RFLP解析はMseI制限酵素を用いて行い、得られたプロファイルをCodon Code Alignerソフトウェアで、これまでに同定された16SrXIIサブグループに属するファイトプラズマの参照配列から仮想的に生成したプロファイルと比較した（Kazeem et al.、2021).5つのサンプルはすべて共通のRFLPプロファイルを示し、それは16SrXII-E参照配列DQ086423 (Valiunas et al., 2006)から仮想的に生成されたものと一致した（補足図2）。これは、我々の知る限り、ハシバミに'Ca.P. fragariae'がイタリアでヘーゼルナッツに寄生したのは、木本植物を宿主とするCornus sanguineaとSambucus nigra（Filippinら、2008）での以前の記録以来のことである。現在、Ca. P. fragariaeのイタリアでの蔓延を評価するため、さらなる調査が進行中である。fragariae'のイタリアンヘーゼルナッツ果樹園における広がりを評価し、推定される媒介昆虫を同定するために、さらなる調査が進行中である。本研究で得られた塩基配列は、GenBank NCBIデータベース（アクセッション番号：MW767127、MW767128、MW767129、MW767130、MW767131）に寄託された。

Italy is the second largest producer of hazelnuts in the world after Turkey. The Viterbo province (Latium region) is one out of the four main productive districts, accounting for approximately 30% of the total Italian production. Several pathogens can severely affect hazelnut trees (Corylus avellana), mainly fungi and bacteria that are commonly spread in all the growing areas. However, other pathogens such as phytoplasmas, are known to infect this crop worldwide. Among these, 'Candidatus Phytoplasma fragariae' (16SrXII-E) has been recently associated with the decline and death of hazelnut trees in UK where it was identified for the first time on this plant species (Hodgetts et al., 2015), and in Slovenia (Mehle et al., 2018; Mehle et al., 2019). In July 2020, a survey was carried out in two orchards located in the Viterbo province, where symptoms resembling those induced by phytoplasmas and consisting in yellowing and rolling of leaves and tree decline (Supplementary figure 1) were recorded by growers. To ascertain the possible presence of phytoplasma infections, leaf samples were collected from five symptomatic plants: one plant from orchard 1, cv. Tonda Gentile Romana and four plants from orchard 2, cv. Tonda di Giffoni. Samples from four non-symptomatic plants (two per each orchard) were also collected and used as negative controls in the detection assays. DNA was extracted from 0.6 g of leaf ribs homogenised in CTAB buffer according to Marzachì et al. (1999). DNA extracts were amplified by direct and nested PCR employing the universal primer pairs P1/P7 and R16F2n/R2 according to the EPPO Standard PM7/133(1) - Appendix 2 (EPPO, 2018). Nested amplicons of the expected size (1,250 bp) were obtained from the five symptomatic samples whereas no bands were observed for the symptomless ones. The R16F2n/R2 fragments were submitted to both Sanger sequencing and RFLP analysis for the phytoplasma identification. Nucleotide BLAST analysis (NCBI) of the obtained sequences showed an identity percentage ranging from 99.65% and 99.91% with numerous strains of 'Ca. Phytoplasma fragariae' (16SrXII-E). The RFLP analysis was performed with the MseI restriction enzyme, and the obtained profiles were compared in the Codon Code Aligner software to those virtually generated from reference sequences of phytoplasmas belonging to the 16SrXII subgroups identified so far (Kazeem et al., 2021). All the five samples showed a common RFLP profile which was ascribable to that virtually generated from the 16SrXII-E reference sequence DQ086423 (Valiunas et al., 2006) (Supplementary figure 2). To our knowledge, this is the first finding of 'Ca. P. fragariae' on hazelnut in Italy since the previous records on woody plant hosts regarded Cornus sanguinea and Sambucus nigra (Filippin et al. 2008). Further surveys are ongoing to assess the spread of 'Ca. P. fragariae' in the Italian hazelnut orchards and to identify the putative insect vectors. The nucleotide sequences obtained in this study were deposited in GenBank NCBI database (accession numbers: MW767127, MW767128, MW767129, MW767130, MW767131).