ODAMはameloblast-like cell line ALCにおいてWNT1シグナル経路の活性化を介してjunctional epithelium関連遺伝子の発現を促進する

ODAM promotes junctional epithelium-related gene expression via activation of WNT1 signaling pathway in an ameloblast-like cell line ALC.

• Danyang Song
• Sui Yang
• Tao Tan
• Ruijie Wang
• Zeyun Ma
• Yixiang Wang
• Lei Wang

抄録

目的:

本研究では、歯芽細胞様細胞株ALCにおいて、odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM)が接合上皮関連遺伝子の発現を促進する可能性とそのメカニズムについて検討した。

OBJECTIVE: In this study, we investigated the potential and mechanism of odontogenic ameloblast-associated protein (ODAM) in the promoting junctional epithelium-related gene expression in an ameloblast-like cell line ALC.

背景:

ODAMは、アメロブラストとJEに発現しており、JEの内基底膜(IBL)と細胞間マトリックスの構成要素として働いている。ODAMのKOマウスでは、歯から剥離するJEの完全性が破壊されていた。ODAMは、ODAM-ARHGEF5-RhoAシグナル伝達経路を介して、日本毛髪の細胞骨格を制御していることが確認された。ODAMがJEのアメロボスト分化の制御に寄与しているかどうかはまだ不明である。エナメル質形成後、アメロブラストは一連の形態的変化を遂げる。ODAMがアメロブラストの生物学的挙動に影響を与え、JEのような特徴を持つようになるかどうかは不明である。

BACKGROUND: ODAM is expressed in ameloblasts and JE and acts as a component of the inner basal lamina (IBL) and intercellular matrix of JE. ODAM KO mice showed destruction of the integrity of the JE, which detaches from teeth. ODAM was confirmed to regulate the cytoskeleton through the ODAM-ARHGEF5-RhoA signaling pathway of the JE. Whether ODAM contributes to the regulation of ameloblast differentiation in JE remains unclear. After the formation of enamel, the ameloblast undergoes a series of morphological changes. Whether ODAM will affect the biological behavior of ameloblasts making them have the characteristics of JE is unclear.

方法:

マウスのアメロブラスト様細胞株ALCを用いて、レンチウイルス導入法によりODAM過剰発現細胞とODAMノックダウン細胞を作製し、上皮誘導環境下におけるALC細胞のJE様変化に対するODAMの影響を調べた。接合部上皮のバイオマーカーであるCK19，SLPI，ODAMと，潜在的な制御遺伝子であるWNT1を，リアルタイムPCR，ウェスタンブロット，免疫細胞化学，免疫染色，ルシフェラーゼレポーター，レスキューアッセイによって調べた。

METHODS: A murine ameloblast-like cell line, ALC, was used to investigate the effects of ODAM on the JE-like changes of ALC cells in an epithelium-induced environment by generating ODAM overexpression and ODAM knockdown cells through a lentivirus transduction approach. The biomarkers of junctional epithelium CK19, SLPI, and ODAM and the potential regulatory gene WNT1 were investigated by real-time PCR, western blot, immunocytochemistry, immunostaining, luciferase reporter, and rescue assays.

結果:

ODAM, CK19, SLPIは、上皮誘導後に有意に上昇した。ODAMをALC細胞で過剰発現させるとCK19とSLPIの発現が顕著に増加し、ODAMをALC細胞でノックダウンするとCK19とSLPIの発現が明らかに減少した。レポータールシフェラーゼアッセイでは、ODAMがWNTシグナル経路、特にWNT1を介して活性化することが示された。ODAMを過剰に発現させるとWNT1の発現が増加し、ノックダウンするとこの効果が逆転した。WNT1阻害アッセイでは、上記の結果をさらに確認し、WNT1経路が接合部上皮のバイオマーカーであるCK19およびSLPIの発現と正の相関関係にあることを示した。レスキュー研究では、ODAMを過剰発現したALC細胞でWNT1をノックダウンすると、CK19とSLPIの発現が減少した。免疫細胞化学では、ODAMが細胞内でCK19、SLPI、WNT1と共局在することが示された。

RESULTS: ODAM, CK19, and SLPI were significantly upregulated after epithelial induction. Overexpression of ODAM in ALC cells markedly increased CK19 and SLPI expression, while knockdown of ODAM in ALC cells clearly decreased CK19 and SLPI expression. A reporter luciferase assay showed that ODAM activated the WNT signaling pathway, especially through WNT1. Exogenous overexpression of ODAM upregulated WNT1 expression, while knockdown of ODAM reversed this effect. The WNT1 inhibition assay further confirmed the above results and showed that the WNT1 pathway was positively correlated with biomarkers of junctional epithelium CK19 and SLPI expression. Rescue studies showed that knocking down WNT1 in the ODAM-overexpressing ALC cells decreased the expression of CK19 and SLPI. Immunocytochemistry showed that ODAM colocalized with CK19, SLPI, and WNT1 in the cells.

おわりに:

以上、本研究では、ODAMがODAM-WNT1軸を介してALCの接合上皮関連遺伝子の発現を促進することを明らかにし、ODAMの機能とJEの形成について新たな知見を得ることができた。

CONCLUSION: In conclusion, the research work showed that ODAM promotes junctional epithelium-related gene expression in ALC via the ODAM-WNT1 axis, which may provide new insight into the function of ODAM and JE formation.

© 2021 John Wiley & Sons A/S. Published by John Wiley & Sons Ltd.