質量分析と結合したマルチPCRを用いたNeisseria gonorrhoeaeにおける抗菌薬耐性の特徴付けのためのマルチプレックスアッセイ

A multiplex assay for characterization of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae using multi-PCR coupled with mass spectrometry.

• Yamei Li
• Leshan Xiu
• Jingwei Liu
• Chi Zhang
• Feng Wang
• Yueping Yin
• Junping Peng

抄録

背景:

淋菌の包括的な抗菌薬耐性（AMR）プロファイルを得るためには，薬剤耐性に関連する複雑なメカニズムと変動する決定因子が大きな課題となっている．一方で，セファロスポリン耐性モザイクpenA対立遺伝子が世界的に報告されている。そのため，セファロスポリン耐性モザイクpenA対立遺伝子の拡大を監視することが急務となっている．

BACKGROUND: Complicated mechanisms and variable determinants related to drug resistance pose a major challenge to obtain comprehensive antimicrobial resistance (AMR) profiles of Neisseria gonorrhoeae. Meanwhile, cephalosporin-resistant mosaic penA alleles have been reported worldwide. Therefore, it is urgent to monitor the expansion of cephalosporin-resistant mosaic penA alleles.

目的:

AMR決定因子を効率的にスクリーニングするための包括的なハイスループットメソッドを開発する。

OBJECTIVES: To develop a comprehensive high-throughput method to efficiently screen AMR determinants.

方法:

19の淋菌AMR遺伝子座（NG-AMR-MS）において、複数の抗菌薬に関連する24の変異を同時にスクリーニングできるMALDI-TOF MSを用いたマルチプレックスPCRに基づく方法を開発した（NG-AMR-MS）。NG-AMR-MS法の性能は、6種類の抗生物質のMICが既知の454個のN. gonorrhoeae分離株、8種類の非淋菌株、214種類の臨床サンプル、およびモザイクpenA対立遺伝子が確認された3種類のプラスミドを検査することで評価されました。

METHODS: We developed a method based on multiplex PCR with MALDI-TOF MS, which can simultaneously screen for 24 mutations associated with multiple antimicrobial agents in 19 gonococcal AMR loci (NG-AMR-MS). The performance of the NG-AMR-MS method was assessed by testing 454 N. gonorrhoeae isolates with known MICs of six antibiotics, eight non-gonococcal Neisseria strains, 214 clinical samples and three plasmids with a confirmed mosaic penA allele.

研究成果:

その結果，NG-AMR-MSの特異度は100％，感度は1反応あたり10コピペ（PorB A121D/N/Gを除くと100コピペ）と低感度であった。淋菌負荷が5copies/μLを超える臨床検体では，20個のAMR変異を正確に同定することができた．さらに、この方法はpenA対立遺伝子のA311V変異を持つ特定のセファロスポリン耐性株を検出することに成功した。

RESULTS: The results show that NG-AMR-MS had a specificity of 100% with a sensitivity as low as 10 copies per reaction (except for PorB A121D/N/G, 100 copies per reaction). For clinical samples with gonococcal load >5 copies/μL, the method can accurately identify 20 AMR mutations. In addition, the method successfully detected specific cephalosporin-resistant strains with the A311V mutation in the penA allele.

結論:

本法は、マルチプレックス形式で包括的なAMRプロファイルを提供することができます。さらに，臨床検体間のAMRスクリーニングにも直接適用でき，N. gonorrhoeaeのAMRを総合的にモニタリングするための有効なツールとなるとともに，モニタリングレベルを総合的に向上させる強力な手段を提供します。

CONCLUSIONS: Our high-throughput method can provide comprehensive AMR profiles within a multiplex format. Furthermore, the method can be directly applied to screening for AMR among clinical samples, serving as an effective tool for overall monitoring of N. gonorrhoeae AMR and also provides a powerful means to comprehensively improve the level of monitoring.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com.