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枯草菌株NCD-2のPhoR/PhoP二成分系によって制御される多剤耐性を表現型マイクロアレイとトランスクリプトーム解析を用いて明らかにした
Using a phenotype microarray and transcriptome analysis to elucidate multi-drug resistance regulated by the PhoR/PhoP two-component system in Bacillus subtilis strain NCD-2.
PMID: 32688186 DOI: 10.1016/j.micres.2020.126557.
抄録
枯草菌において最も重要なシグナル伝達経路の一つであるPhoRP二成分系（TCS）は、主にリン酸飢餓条件下で細胞の生理反応を制御している。本研究では、PhoRP TCSが枯草菌NCD-2株の抗生物質耐性を制御するメカニズムを明らかにした。枯草菌株NCD-2の240種類の抗菌薬に対する感受性を、表現型マイクロアレイ（PM）技術を用いて、野生型、phoR-null変異体（MR）、phoP-null変異体（MP）で比較した。その結果，MR変異体は機能の異なる13種類の抗生物質に対して，MP変異体は14種類の抗生物質に対して耐性を示し，そのうち8種類は30S/50Sリボソームを標的とした抗生物質であった。抗生物質耐性レベルの変化に関与する分子機構を調べるために，転写解析を行い，野生型株とMR，MP変異株の間で発現の異なる遺伝子を比較した。その結果，MR変異体では，野生型株と比較して294個の遺伝子が異なって発現しており，そのうち97個のアップレギュレーション遺伝子と197個のダウンレギュレーション遺伝子が発現していた。発現の異なる遺伝子の多くは、炭水化物機構、アミノ酸機構、ABC トランスポーター、リン酸化酵素系に関連していた。MP変異体では、10個のアップレギュレーション遺伝子と202個のダウンレギュレーション遺伝子を含む合計212個の遺伝子が異なって発現しており、そのほとんどがリボソーム合成、アミノ酸代謝、炭水化物代謝、ABCトランスポーターに関連していた。MP変異体でアップレギュレーションされていたkhtSTUオペロン（K efflux pumpをコードする）は、MP変異体ではインフレーム欠失により欠失した。phoPとkhtSTUオペロンの二重変異体MPKは、MP変異体と比較して、ドキシサイクリン、クロルテトラサイクリン、スピラマイシン、ピュロマイシン、パロマイシンに対する抗生物質耐性が低下していた。このことから、PhoPが媒介する多発性抗生物質耐性はkhtSTUオペロンが担っていることが示唆された。
The PhoRP two-component system (TCS), one of the most important signaling pathways in Bacillus subtilis, regulates cell physiological reactions mainly under phosphate starvation conditions. The mechanism by which PhoRP TCS regulates resistance towards antibiotics in B. subtilis strain NCD-2 was investigated in this study. Using phenotype microarray (PM) technology, the susceptibility of B. subtilis to 240 antimicrobial compounds was compared among the wild-type strain NCD-2, the phoR-null mutant (MR), and the phoP-null mutant (MP). Compared with the wild type, the MR mutant was more resistant to 13 antibiotics with different functions, and the MP mutant was more resistant to 14 antibiotics, of which 8 were 30S/50S ribosome-targeted. To investigate the molecular mechanisms involved in changing the level of antibiotic resistance, transcriptional analysis was performed to compare the differentially expressed genes among the wild-type strain and the MR and MP mutants. Compared with the wild-type strain, 294 genes were differentially expressed in the MR mutant, including 97 up-regulated genes and 197 down-regulated genes. Most of the differently expressed genes were associated with carbohydrate mechanism, amino acid mechanism, ABC-transporters and phosphotransferase systems. A total of 212 genes were differentially expressed in the MP mutant, including 10 up-regulated genes and 202 down-regulated genes, and most were associated with ribosome synthesis, amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and ABC-transporters. The khtSTU operon (encoding the K efflux pump) that was up-regulated in the MP mutant was deleted by in-frame deletion in the MP mutant. The phoP and khtSTU operon double mutant MPK showed decreased antibiotic resistance to doxycycline, chlortetracycline, spiramycin, puromycin, and paromomycin when compared with the MP mutant. Thus, the results indicated that the khtSTU operon was responsible for the PhoP-mediated multiple antibiotic resistance.
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