脂肪組織内の幹細胞の埋蔵量を保持するための非毒性の凍結培地

Non-toxic freezing media to retain the stem cell reserves in adipose tissues.

• Shahensha Shaik
• Xiying Wu
• Jeffrey M Gimble
• Ram Devireddy

抄録

皮下脂肪組織は間質血管画分（SVF）と脂肪由来の間質/幹細胞（ASC）の豊富な供給源であり、これらは本来多能性を持ち、再生特性を示す。現在の実務では、脂肪吸引手術から採取された脂肪吸引標本は、簡単で費用対効果が高く、検証された凍結保存プロトコルがないため、バイオハザード廃棄物として日常的に廃棄されている。本研究の目的は、達成可能な温度（-20℃または-80℃）で保存した場合に、脂肪移植および／または間質細胞／幹細胞の分離に適した脂肪アスピレー ト組織の短期保存（最大6ヶ月）を可能にする、異種タンパク質を含まない凍結保護剤のカクテルを開発することであった。選択的な美容脂肪吸引手術を受けた3名の同意を得た健康なドナーから提供されたリポアスピレー トは、5つの凍結媒体（FM1：10% DMSOと35% BSA、FM2：2% DMSOと43% BSA、FM3：10% DMSOと35% lipoaspirate saline、FM4：2% DMSOと6% HSA。2％DMSOおよび6％HSA、およびFM5：40％リポアスピレート生理食塩水および10％PVP）すべて1X DMEM/F12に懸濁し、市販のフリーザー（-20℃または-80℃）を使用して凍結させ、少なくとも1ヶ月間保存した。1ヶ月間の凍結保存後、凍結解凍したリポアスピレーツからコラゲナーゼタイプIで消化することにより、SVF細胞とASCを単離した。リポアスピレーツから分離したSVFは、-80℃で凍結保存した場合、試験した凍結培地（FM2, FM3, FM4）では、従来のDMSO培地や動物血清培地（FM1）と同等の細胞生存率を保持したが、FM5培地では生存率が低かった。対照的に、-20℃で凍結保存した組織は、解凍およびコラゲナーゼ消化後、生きたSVF細胞を得なかった。また、凍結リポアスピレーツを-80℃で凍結保存したASCの表面マーカー（CD90、CD29、CD34、CD146、CD31、CD45）の発現を評価したところ、両群間に有意な差は認められなかった。また、組織化学的染色とqRT-PCRによる遺伝子発現を用いて、脂肪原性と骨原性の分化能を調べた。脂肪形成性のオイルレッドO染色の結果、CPA培地FM1、FM4、FM5はロバストな分化を示した。骨形成のためのアリザリンレッドS染色は、FM1およびFM4培地が他の試験培地と比較して優れた分化を示したことを明らかにした。qRT-PCRによる脂肪形成および骨形成遺伝子発現の測定は、同様の結果を提供し、FM4 CPA培地は、脂肪形成および骨形成に関してFM1と同等であることを示した。

Subcutaneous adipose tissue is a rich source of stromal vascular fraction (SVF) and adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) that are inherently multipotent and exhibit regenerative properties. In current practice, lipoaspirate specimens harvested from liposuction surgeries are routinely discarded as a biohazard waste due to a lack of simple, cost effective, and validated cryopreservation protocols. The aim of this study was to develop a xenoprotein-free cryoprotective agent cocktail that will allow for short-term (up to 6 months) preservation of lipoaspirate tissues suitable for fat grafting and/or stromal/stem cell isolation when stored at achievable temperatures (-20 °C or -80 °C). Lipoaspirates donated by three consenting healthy donors undergoing elective cosmetic liposuction surgeries were suspended in five freezing media (FM1: 10% DMSO and 35% BSA; FM2: 2% DMSO and 43% BSA; FM3: 10% DMSO and 35% lipoaspirate saline; FM4: 2% DMSO and 6% HSA; and FM5: 40% lipoaspirate saline and 10% PVP) all suspended in 1X DMEM/F12 and frozen using commercially available freezers (-20 °C or -80 °C) and stored at least for a 1 month. After 1 month of freezing storage, SVF cells and ASCs were isolated from the frozen-thawed lipoaspirates by digestion with collagenase type I. Cell viability was evaluated by fluorescence microscopy after staining with acridine orange and ethidium bromide. The SVF isolated from lipoaspirates frozen at -80 °C retained comparable cell viability with the tested freezing media (FM2, FM3, FM4) comparable with the conventional DMSO and animal serum media (FM1), whereas the FM5 media resulted in lower viability. In contrast, tissues frozen and stored at -20 °C did not yield live SVF cells after thawing and collagenase digestion. The surface marker expression (CD90, CD29, CD34, CD146, CD31, and CD45) of ASCs from frozen lipoaspirates at -80 °C in different cryoprotectant media were also evaluated and no significant differences were found between the groups. The adipogenic and osteogenic differentiation potential were studied by histochemical staining and gene expression by qRT-PCR. Oil Red O staining for adipogenesis revealed that the CPA media FM1, FM4 and FM5 displayed robust differentiation. Alizarin Red S staining for osteogenesis revealed that FM1 and FM4 media displayed superior differentiation in comparison to other tested media. Measurement of adipogenic and osteogenic gene expression by qRT-PCR provided similar outcomes and indicated that FM4 CPA media comparable with FM1 for adipogenesis and osteogenesis.

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