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ヒト・イヌ感染症の診断：組換え蛋白質を用いた間接酵素免疫吸着法の開発と評価
Diagnosis of human and canine infection: development and evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assays using recombinant proteins.
PMID: 32685723 PMCID: PMC7358725. DOI: 10.1016/j.heliyon.2020.e04393.
抄録
グラム陰性球菌属に属する球菌は、犬やヒトに感染症を引き起こす病原性細菌である。これまでに複数の研究が行われ、すべての人獣共通感染症を検出するための診断技術が開発されている。感染症の診断は、高特異性・高感度の診断法がないために困難である。本研究は、2つのフェーズに分けて行われました：最初のフェーズでは、ブルセラ症の血清学的診断に使用できる可能性のある抗原性タンパク質が同定されました。犬のブルセラ症感染陽性のヒト血清は、免疫反応性タンパク質を認識するために使用され、2D-GELおよびイムノブロットアッセイを実行することによって同定されました。これらのスポットをMALDI TOF MSを用いて解析し、予測されたタンパク質を同定した。解析された35個のタンパク質スポットのうち、14個のタンパク質が同定され、その後バイオインフォマティクスを用いて特徴付けが行われ、そのうちの2個が次のフェーズに向けて選択された。第二段階では、これらの組換えタンパク質：イノシン５'リン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１サブユニットベータ（ＰｄｈＢ）および伸長因子Ｔｕｆ（Ｔｕｆ）を用いた間接的な酵素結合免疫吸着アッセイを開発し、検証した。これらの遺伝子をOliveri株のゲノムDNAからPCR増幅し、クローニングし、.NETで発現させた。組換え蛋白質を金属アフィニティークロマトグラフィーで精製し、間接ELISAで抗原として使用した。間接ELISAの性能を評価するために，健康なヒトと感染したイヌの血清サンプルを用いた。その結果、PdhBおよびTufタンパク質は、ヒトでは感染症の血清学的検出の抗原として使用できるが、イヌでは使用できないことが示唆された。ヒト血清中の-特異的抗体を検出するためのiELISAアッセイにおける組換え抗原の使用は、.PdhBおよびTufタンパク質によって引き起こされるヒトブルセラ症の診断を改善するための貴重なツールとなり得る。
, a Gram-negative coccobacilli belonging to the genus , is a pathogenic bacterium that can produce infections in dogs and humans. Multiple studies have been carried out to develop diagnostic techniques to detect all zoonotic . Diagnosis of infection is challenging due to the lack of highly specific and sensitive diagnostic assays. This work was divided in two phases: in the first one, were identified antigenic proteins in that could potentially be used for serological diagnosis of brucellosis. Human sera positive for canine brucellosis infection was used to recognize immunoreactive proteins that were then identified by performing 2D-GEL and immunoblot assays. These spots were analyzed using MALDI TOF MS and predicted proteins were identified. Of the 35 protein spots analyzed, 14 proteins were identified and subsequently characterized using bioinformatics, two of this were selected for the next phase. In the second phase, we developed and validated an indirect enzyme-linked immunosorbent assays using those recombinant proteins: inosine 5' phosphate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta (PdhB) and elongation factor Tu (Tuf). These genes were PCR-amplified from genomic DNA of strain Oliveri, cloned, and expressed in . Recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography, and used as antigens in indirect ELISA. Serum samples from healthy and -infected humans and dogs were used to evaluate the performance of indirect ELISAs. Our results suggest that PdhB and Tuf proteins could be used as antigens for serologic detection of infection in humans, but not in dogs. The use of recombinant antigens in iELISA assays to detect -specific antibodies in human serum could be a valuable tool to improve diagnosis of human brucellosis caused by .
© 2020 The Authors.