大腸菌におけるメジャーキャプシドタンパク質HPV 16L1非集合バリアントの最適化生産戦略

Optimized production strategy of the major capsid protein HPV 16L1 non-assembly variant in E. coli.

• Nora Roos
• Bastian Breiner
• Laura Preuss
• Hauke Lilie
• Katharina Hipp
• Holger Herrmann
• Thomas Horn
• Richard Biener
• Thomas Iftner
• Claudia Simon

抄録

ヒトパピローマウイルス（HPV）のキャプシドは、大キャプシドタンパク質L1と小キャプシドタンパク質L2の2つのキャプシドタンパク質で構成されています。L1タンパク質のみで構成されたウイルス様粒子は、HPV感染症の予防ワクチンとして応用されています。また、キャプシドのサブユニットはL1-ペンタマーであり、動物のHPV感染症を効率的に防御することが報告されています。L1の組換え生産は、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物、哺乳類の細胞培養において以前に示されています。主に大腸菌を用いた発現系では、L1は高い発現収率を示すが、タンパク質は大部分が不溶性である。この問題を克服するために、融合タンパク質やバクテリアのシャペロンを過剰発現させる方法が報告されている。しかし、融合タンパク質の切断が不十分であったり、共精製されたシャペロンが除去されていたりすると、その後のダウンストリーミングが阻害される可能性がある。本研究では、(I)N末端SUMOタグをL1に融合させること、(II)シャペロン系GroEL/ESの異種共発現、(III)低温発現を組み合わせることにより、可溶性L1ペンタマーの産生が大幅に改善されたことを報告している。融合構築物を、GroEL/ESの効率的な除去およびN末端SUMOタグの完全な除去を含む2段階のタンパク質精製で精製した。発現戦略は、良好な製造慣行のガイドラインに従って、定義された培地を用いたプロセス制御された高細胞密度発酵に移行させた。生産されたL1タンパク質は、高純度（>95％）であり、DNAを含まず（260：280＝0.5）、五量体である。生産戦略は、1グラムの乾燥バイオマスあたり5.73mgの精製L1-ペンタマーを産出した。最適化された戦略は、ワクチン生産のためのより安価なプロセスとして、高収量のL1-ペンタマーの生産および精製のための適切な代替手段である。

The capsid of human papillomavirus (HPV) consists of two capsid proteins - the major capsid protein L1 and the minor capsid protein L2. Assembled virus-like particles, which only consist of L1 proteins, are successfully applied as prophylactic vaccines against HPV infections. The capsid subunits are L1-pentamers, which are also reported to protect efficiently against HPV infections in animals. The recombinant production of L1 has been previously shown in E. coli, yeast, insect cells, plants and mammalian cell culture. Principally, in E. coli-based expression system L1 shows high expression yields but the protein is largely insoluble. In order to overcome this problem reported strategies address fusion proteins and overexpression of bacterial chaperones. However, an insufficient cleavage of the fusion proteins and removal of co-purified chaperones can hamper subsequent down streaming. We report a significant improvement in the production of soluble L1-pentamers by combining (I) a fusion of a N-terminal SUMO-tag to L1, (II) the heterologous co-expression of the chaperon system GroEL/ES and (III) low expression temperature. The fusion construct was purified in a 2-step protein purification including efficient removal of GroEL/ES and complete removal of the N-terminal SUMO-tag. The expression strategy was transferred to process-controlled high-cell-density fermentation with defined media according to the guidelines of good manufacturing practice. The produced L1 protein is highly pure (>95 %), free of DNA (260:280 = 0.5) and pentameric. The production strategy yielded 5.73 mg of purified L1-pentamers per gram dry biomass. The optimized strategy is a suitable alternative for high yield L1-pentamer production and purification as a cheaper process for vaccine production.

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