電子顕微鏡による新規合成RNAのシトシンメチル化のタイミング

Timing of Cytosine Methylation on Newly Synthesized RNA by Electron Microscopy.

• Lorena Zannino
• Stella Siciliani
• Marco Biggiogera

抄録

RNAヌクレオチドが、シトシン上のメチル化などのエピジェネティックな修飾を受けることが、ますます多くのエビデンスで示されている。mRNA上で修飾された塩基の存在は証明されているが、その分子的意義はほとんど明らかにされていない。本研究では、シトシンの5-メチルシトシン（5mCまたはmC）への修飾のタイミングをRNAの伸長と処理に関連させて解析する方法について述べる。これを行うために、我々は、RNAポリメラーゼIIによって認識され、ナッセントRNAに組み込まれることができる2つの合成的に修飾されたヌクレオチド塩基であるクロルウリジンとヨードウリジンを使用しています。これらの修飾塩基は、定義された時間間隔で細胞培養に添加され、その後、修飾ヌクレオチドに対する抗体を用いた免疫細胞化学染色が行われる。この方法により、5mCがナッセントmRNA中で産生される時間の範囲を特定することができる。この方法は、電子顕微鏡の超解像感が得られるため、ナッセントRNA分子の伸長過程を追跡することが可能となります。

Increasing evidence demonstrates that RNA nucleotides undergo epigenetic modifications, such as methylation on cytosine. Although the presence of modified bases on mRNA has been proven, their molecular significance is largely undefined. We describe here a methodology to dissect the timing of modification of cytosine to 5-methylcytosine (5mC or mC) in relation to RNA elongation and processing. To do this we use chlorouridine and iodouridine, two synthetically modified nucleotide bases which can be recognized by RNA polymerase II and incorporated into nascent RNA. These modified bases are added to a cell culture for defined intervals of time, and then immunocytochemical staining using antibodies against the modified nucleotides is carried out. This procedure allows us to identify the range of time in which 5mC is produced in nascent mRNA. This method provides the ultra-resolution of electron microscopy and allows following nascent RNA molecules during their elongation.