Glossoscolex paulistus（HbGp）の細胞外ヘモグロビンのアポフォームの特性と尿素の存在下での安定性

Characterization of the apo-form of extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) and its stability in the presence of urea.

• Ana E B Barros
• Célia Sulzbacher Caruso
• Fernanda Rosa Alves
• Marcel Tabak
• Francisco A O Carvalho

抄録

ヘム基を欠いたアポ形態のミオグロビンなどの小さなヘム含有タンパク質の構造研究は広く行われてきたが、ヘム基を欠いた巨大なグロッソスコレックス・パウリスタス・ヘモグロビン（HbGp）の特性と安定性については、これまで研究されていなかった。分光学的データは、ヘモグロビンからヘム基の効率的な抽出を示し、アポ-HbGpの二次および三次構造変化はオキシ-HbGpに比べて比較的小さいことに気づいた。電気泳動は、ヘム基の抽出に起因する三量体abcの部分的な沈殿（ゲル内の対応するバンドの有意に低い強度）を示しており、強烈なモノマーのdバンドの優位性だけでなく、2つのリンカーバンドの。AUCとDLSのデータは、アポ-HbGpがdとabcのサブユニットに解離を経ることを示すという点でSDS-PAGEと一致しています。サブユニットdとabcは、それぞれ沈降係数と2.0と3.0S、76と24％の割合で特徴づけられている。DLSデータは、アポ-HbGpが不安定であることを示唆しており、2つの集団が溶液中に存在している：解離した種と同定された6.0nm付近の直径を有するもの、および凝集したタンパク質に起因する直径100〜180nmを有する第2のもの。最後に、尿素の存在は、アンフォールディングプロセスに起因する水性溶媒への蛍光プローブ、外因性ANSおよび内因性タンパク質トリプトファンの露出を促進する。ヘムタンパク質の安定性に対するヘム抽出の効果を理解することは、非ネイティブプロテスタント基の導入や設計された特性を持つ人工酵素の開発などのバイオテクノロジーのアプローチにとって重要である。

The structural study of small heme-containing proteins, such as myoglobin, in the apo-form lacking heme has been extensively described, but the characterization and stability of the giant Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp), in the absence of heme groups, has not been studied. Spectroscopic data show efficient extraction of the heme groups from the hemoglobin, with relatively small secondary and tertiary structural changes in apo-HbGp noticed compared to oxy-HbGp. Electrophoresis shows a partial precipitation of the trimer abc (significantly lower intensity of the corresponding band in the gel), due to extraction of heme groups, and the predominance of the intense monomeric d band, as well as of two linker bands. AUC and DLS data agree with SDS-PAGE in showing that the apo-HbGp undergoes dissociation into the d and abc subunits. Subunits d and abc are characterized by sedimentation coefficients and percentage contributions of 2.0 and 3.0 S and 76 and 24%, respectively. DLS data suggest that the apo-HbGp is unstable, and two populations are present in solution: one with a diameter around 6.0 nm, identified with the dissociated species, and a second one with diameter 100-180 nm, due to aggregated protein. Finally, the presence of urea promotes the exposure of the fluorescent probes, extrinsic ANS and intrinsic protein tryptophans to the aqueous solvent due to the unfolding process. An understanding of the effect of heme extraction on the stability of hemoproteins is important for biotechnological approaches such as the introduction of non-native prosthetic groups and development of artificial enzymes with designed properties.