特定の糖鎖配列とタンパク質との結合を調べるためのヘパラン硫酸マイクロアレイの構築

Construction of heparan sulfate microarray for investigating the binding of specific saccharide sequences to proteins.

• Maurice Horton
• Guowei Su
• Lin Yi
• Zhangjie Wang
• Yongmei Xu
• Vijayakanth Pagadala
• Fuming Zhang
• David A Zaharoff
• Ken Pearce
• Robert J Linhardt
• Jian Liu

抄録

ヘパラン硫酸(HS)は不均一な細胞外糖鎖であり、多くの生物学的プロセスに影響を与えるタンパク質や他の分子と相互作用する。HS相互作用の特異的な結合モチーフには関心がありますが、広範囲に特徴づけられていませんでした。グリカンマイクロアレイは、比較的少量のサンプルに依存しながら、グリカンとそのリガンド間の相互作用をプローブするために使用できる貴重なツールである。最近では、HSの化学酵素合成が、他の方法では困難な特定のHS構造を生成するために採用されている。本研究では、化学酵素的に合成された多様なHS構造のマイクロアレイを開発し、その相互作用を調べた。このマイクロアレイの有用性を確認するために、蛍光標識されたアンチトロンビンIII（AT）と線維芽細胞増殖因子2（FGF2）を95種類のHS構造に対して3種類の印刷濃度でスクリーニングした。特異的な硫酸化パターンがこれらのタンパク質との結合に重要であることが判明し、その結果はこれまでの特異性研究と一致した。さらに、ATとFGF2の複数のHS構造に対する結合親和性(KD,surf)をマイクロアレイを用いて決定したところ、これまでの報告と一致した。最後に、95化合物HSマイクロアレイを用いて、インターロイキン12(IL-12)および血小板因子4(PF4)の明確な結合プロファイルを決定した。この技術は、迅速な展開に理想的であり、生物学的に重要な構造/機能の関係をハイスループットで特徴付けるために極めて重要である。

Heparan sulfate (HS) is a heterogeneous, extracellular glycan that interacts with proteins and other molecules affecting many biological processes. The specific binding motifs of HS interactions are of interest, but have not been extensively characterized. Glycan microarrays are valuable tools that can be used to probe the interactions between glycans and their ligands while relying on relatively small amounts of samples. Recently, chemoenzymatic synthesis of HS has been employed to produce specific HS structures which can otherwise be difficult to produce. In this study, a microarray of diverse chemoenzymatically synthesized HS structures was developed and HS interactions were characterized. Fluorescently labeled antithrombin III (AT) and fibroblast growth factor-2 (FGF2) were screened against 95 different HS structures under three different printing concentrations to confirm the utility of this microarray. Specific sulfation patterns were found to be important for binding to these proteins and results are consistent with previous specificity studies. Furthermore, the binding affinities (KD,surf) of AT and FGF2 to multiple HS structures was determined using a microarray technique and is consistent with previous reports. Lastly, the 95 compound HS microarray was used to determine the distinct binding profiles for interleukin 12 (IL-12) and platelet factor 4 (PF4). This technique is ideal for rapid expansion and will be pivotal to the high throughput characterization of biologically important structure/function relationships.

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